Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Stuttgart, Univ., Diss., 2000.

Proefschrift Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Ton van Helvoort. Samenvatting in het Nederlands. Met lit.opg. en een samenvatting in het Nederlands.

La recherche sur le VHC a longtemps été freinée par l'absence de modèle d'étude permettant l'amplification de ce virus en culture cellulaire. Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que la difficulté à mettre en culture les isolats cliniques du VHC pouvait être due à la présence de facteurs de restriction dans le sérum des patients. En utilisant des sérums séronégatifs pour le VHC, nous avons confirmé l'existence de facteurs sériques inhibiteurs. En combinant des étapes de précipitation au polyéthylène glycol, de gradient d'iodixanol et de chromatographie d'exclusion stérique, nous avons obtenu une fraction purifiée enrichie en facteurs inhibiteurs, à partir des sérums séronégatifs pour le VHC. L'analyse en spectrométrie de masse a permis d’identifier l'apolipoprotéine(a) (apo(a)) comme un inhibiteur potentiel de l'entrée du VHC. En utilisant un virus recombinant dérivé de la souche JFH1, nous avons confirmé que la lipoprotéine(a) plasmatique et recombinante étaient capables d'inhiber spécifiquement le VHC en interagissant avec les particules infectieuses. En utilisant la lectine WGA, qui est connue pour interagir spécifiquement avec la Lp(a), nous avons montré qu’il était possible de réduire l'effet inhibiteur de l'apo(a) et de rétablir l'infection par le VHC. De façon intéressante, nous avons aussi observé que la protéine apo(a) seule, sous forme recombinante purifiée, était suffisante pour inhiber le VHC. Nos résultats suggèrent également que les isoformes courtes sont moins inhibitrices que les longues. Au final, nos résultats mettent en évidence que l'apo(a) est un nouveau composant du métabolisme lipidique capable de moduler l'infection par le VHC / HCV is not an easy virus to work with and it has been necessary to overcome significant hurdles to establish HCV cell culture models. In this study we hypothesized that this hindrance could be due to the presence of restriction factors in patient serum. Thus, using HCV seronegative sera, we confirmed our hypothesis. Combining polyethylene glycol precipitation, iodixanol gradient and size-exclusion chromatography, we obtained a purified fraction enriched in inhibitory factors from HCV seronegative sera. Mass spectrometry analysis identified apolipoprotein(a) (apo(a)) as a potential inhibitor of HCV entry. Using a recombinant virus derived from the JFH1 strain we confirmed that plasma-derived and recombinant lipoprotein(a) as well as purified recombinant apo(a) variants were able to specifically inhibit HCV by interacting with infectious particles. Using wheat germ agglutinin (WGA) lectin, that is well known to specifically interact with Lp(a), it was possible to reverse the apo(a) inhibitory effect and restore the HCV infection. Our results also suggest that small isoforms are less inhibitory than the large ones. Altogether, our results identify apo(a) as an additional component of the lipid metabolism modulating HCV infection

La protéine cellulaire BST2/Tetherin est un médiateur de l’immunité innée qui exerce son activité antivirale contre la dissémination de nombreux virus enveloppés. Ce facteur de restriction retient physiquement les virus néoformés à la surface cellulaire de la cellule infectée, empêchant ainsi le relâchement des virions du VIH-1. La protéine Vpu du VIH-1 est l’un des acteurs viraux capable de contrer cette restriction : elle diminue le niveau d’expression de BST2/Tetherin présent au site de bourgeonnement viral et restaure ainsi une production virale efficace. A ce jour, les mécanismes exacts par lesquels Vpu contre cette barrière cellulaire ne sont pas bien caractérisés. Des études récentes ont montré que HRS et Rab7A, deux protéines contrôlant la voie endo/lysosomale tardive sont impliquées dans le mécanisme déployé par Vpu pour contrer la restriction imposée par BST2. De manière intéressante, ces protéines sont également requises pour l’achèvement des étapes finales de l’autophagie. L’autophagie (macroautophagie) est un mécanisme cellulaire hautement conservé, qui permet la dégradation de composants cytoplasmiques via la formation d’une vésicule à double membrane, appelé autophagosome. L’autophagie est contrôlée par une trentaine de protéines ATG (AuTophaGy-related genes) qui sont recrutés au site de formation du phagophore qui conduira, suite à son élongation, à la formation de l’autophagosome. Il a récemment été décrit que certaine protéines ATG sont également impliquées dans d’autres fonctions cellulaires indépendante de l’autophagie, comme la résistance contre certains pathogènes. C’est le cas notamment de la phagocytose médiée par LC3 (LC3-associated phagocytosis, LAP), un mécanisme indépendant du complexe de pré-initiation de l’autophagie au cours duquel certaines protéines ATG modifient la membrane du phagosome et accélèrent la dégradation des éléments phagocytés. L’objectif de ma thèse était donc de définir si l’autophagie ou certaines protéines de l’autophagie sont impliquées dans le mécanisme moléculaire déployée par Vpu pour contrer la restriction imposée par BST2/Tetherin sur la production virale. Au cours de ma thèse, nous avons démontré l’implication de la protéine LC3C dans le mécanisme par lequel Vpu contrecarre la restriction imposée par BST2 sur la libération des particules virales du VIH-1 dans le milieu extracellulaire. Plus précisément, nos résultats montrent que les protéines ATG5 et Bécline 1, et non tous les composants de l’autophagie, agissent avec la protéine LC3C pour faciliter l’action de la protéine virale Vpu sur la restriction imposée par BST2. L’expression de la protéine LC3C favorise l’élimination par Vpu des molécules de BST2 présentes au site du bourgeonnement, permettant ainsi une libération plus efficace de particules virales VIH-1. Nos expériences d’immunofluorescence montrent que les protéines BST2 et Vpu sont présentes dans des compartiments marqués par LC3, protéine décorant les phagophores, autophagosomes et phagosomes impliqués dans la LAP. Enfin, nos données biochimiques révèlent une interaction spécifique et directe entre la protéine Vpu et la protéine LC3C via un motif LIR non-canonique. L’intégrité de ce motif présent dans le domaine cytoplasmique de Vpu est nécessaire pour la levée par Vpu de la restriction imposée par BST2. En conclusion, mes travaux de thèse montrent que la protéine Vpu du VIH-1 via son interaction avec la protéine d’autophagie LC3C utilise un mécanisme de LAP pour contrer la restriction induite par BST2 sur la production de virus VIH-1. / BST2/Tetherin is a key mediator of the innate immune system that restricts the dissemination of enveloped viruses. This restriction factor impedes the release of de novo formed HIV particles by physically retaining them at the surface of infected cells. The HIV-1 protein Vpu promotes the release of virus by counteracting this restriction. Vpu removes BST2 present at the budding site and downregulates BST2. The mechanisms by which Vpu counteracts BST2 are still not well understood. Recently, we showed that HRS and Rab7A, two regulators of the endocytic and autophagic pathway participates to the mechanism by which Vpu counteracts BST2-mediated restriction on HIV-1 release. Interestingly, these two proteins are also required in the autophagy pathway. Autophagy (macroautophagy) is a highly conserved degradative mechanism that leads to degradation of cytosolic components through the formation of double-membrane vacuoles called autophagosomes that sequester cytosolic material. This process is tightly regulated by the ATG proteins that are hierarchically recruited at the phagophore assembly site to form the autophagosome. Some ATG proteins are additionally involved in non autophagic cell functions involved in maintenance of cell homeostasis and resistance of pathogens. Notably, they participate in microbe clearance through LC3-associated phagocytosis, a process independent of autophagic preinitiation complex in which some ATG proteins directly modify the phagosomal membrane to enhance degradation of phagocytosed elements. The aim of my thesis was to explore if the autophagy pathway or some ATG proteins could be involved in the molecular mechanism by which Vpu counteracts BST2/Tetherin on HIV-1 release. Here, we reveal that the protein LC3C is required in the Vpu-induced antagonism of BST2 restriction. Our results show that only ATG5 and Beclin-1, and not all the components of the autophagy pathway, act with LC3C to favor the counteraction of Vpu on BST2 restriction, and thus enhance HIV-1 release. We report that BST2 and Vpu are present in LC3-positive compartments. We found that Vpu selectively interacts with the ATG8 ortholog, LC3C, through a non-canonical LIR motif by immunoprecipitation and GST pulldown assays. This motif is required for Vpu to antagonize BST2 restriction. LC3C expression favors the removal of BST2 from HIV-1 budding site, and thus HIV-1 release in BST2 expressing cells. Altogether, our data support the view that Vpu uses a non-canonical autophagy pathway reminiscent of LC3-associated phagocytosis to counteract BST2 restriction.

Le virus HTLV-1 est le seul rétrovirus humain oncogène découvert à ce jour à l’origine d’une lymphoprolifération maligne à cellules T, la leucémie aiguë de l’adulte (ATL). L’oncoprotéine Tax du virus HTLV-1 joue un rôle majeur dans l’établissement de la leucémie mais aussi dans la réplication du virus. Tax régule la transcription du promoteur viral situé au sein du LTR 5’ du virus, gouvernant ainsi sa propre production. Pour ce faire, Tax recrute des dimères du facteur de transcription cellulaire CREB, sous forme phosphorylée, au niveau d’éléments de réponse à l’AMP cyclique (vCRE) situés dans la partie U3 du LTR. La phosphorylation de CREB est un processus crucial pour la transactivation du promoteur viral. CREB est aussi ciblé et régulé par OGlcNAcylation, modification post traductionnelle impliquée dans de nombreuses pathologies comme le cancer, dont la régulation dépend de deux enzymes, l’OGA et l’OGT, formant le complexe OGlcNAzyme. Du fait que Tax dérégule de nombreuses machineries de modifications post traductionnelles et que la OGlcNAcylation régule avec la phosphorylation la stabilité et l‘activité de facteurs de transcriptions, nous avons évalué pour la première fois le statut de la OGlcNAcylation de CREB dans le cadre de l’infection par HTLV-1 et son implication sur la régulation du promoteur viral. Nous avons pu montrer que dans le cadre de l’infection par HTLV-1, la protéine Tax dérégulait la machinerie de OGlcNAcylation en inhibant l’activité de l’OGA. Pour ce faire, Tax interagit avec le complexe OGlcNAzyme entrainant une augmentation de la OGlcNAcylation de CREB favorisant ainsi la transcription du LTR 5’. Ainsi nous avons pu établir pour la première fois une relation entre Tax et la OGlcNAcylation permettant de proposer un nouveau modèle de régulation du LTR viral. / HTLV-1 virus is the only oncogenic human retrovirus discovered to date. It is responsible for a T cell malignant lymphoproliferation named Adult T cell Leukemia. HTLV-1 Tax oncoprotein plays a major role in the development of the leukemia and also in the viral replication. Tax regulates the transcription from the viral promoter located in the virus 5’LTR, favoring its own transcription. In order to do this, Tax recrutes dimers of the phosphorylated cellular transcription factor CREB to viral cyclic AMP response elements (vCRE) situated in the U3 part of the LTR. CREB phosphorylation is a crucial process to allow the transactivation of the viral promoter. CREB is also targeted and regulated by OGlcNAcylation which is a post-translational modification implicated in many pathologies such as cancer. Its regulation depends on two enzymes, OGA and OGT forming the OGlcNAzyme complex. As Tax deregulates many post-translational modification machineries and as OGlcNAcylation regulates the stability and activity of transcriptional factors together with phosphorylation, we have evaluated for the first time the OGlcNAcylation status of CREB in the context of HTLV-1 infection and its implication in the regulation of the viral promoter. We have shown that in the context of HTLV-1 infection, Tax protein was deregulating the OGlcNAcylation machinery leading to an increase in CREB OGlcNAcylation which favors the transcription from the 5’LTR. Thus we have established for the first time a relationship between Tax and OGlcNAcylation allowing us to propose a new model of regulation of the viral LTR.

Thèse de doctorat : mathématiques appliquées : Ecole centrale de Paris : 2009. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 422 réf.