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Detecção e identificação de genes de resistência aos antimicrobianos e de virulência em Enterococcus spp. isolados de alimentos e de amostras clínicas /Silva, Simone Quintão. January 2016 (has links)
Orientador: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Banca: Dirce Yorika Kabuki / Banca: Mariza Landgraf / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Aripuanã Sakura Aranha Watanabe / Resumo: A resistência bacteriana aos antimicrobianos é um importante problema de saúde pública. Nos últimos anos tem sido frequente o isolamento de bactérias resistentes a partir de animais de produção e alimentos de origem animal. O objetivo desse estudo é identificar em Enterococcus spp. isolados de carnes (suína, bovina e frango) e de queijo Minas Frescal, o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos e a diversidade de genes de resistência aos antimicrobianos e de genes de virulência. Os resultados são comparados ao perfil observado em Enterococcus spp. isolados de pacientes internados em um hospital terciário no estado de São Paulo. Foram avaliados 102 Enterococcus spp. isolados de alimentos e 46 isolados clínicos. Entre os isolados de alimentos, 39% apresentaram resistência à tetraciclina, 32% à eritromicina, 17,5% à estreptomicina, 13% à norfloxacina, 10% ao cloranfenicol, 8% à ciprofloxacina e à fosfomicina, 6% à levofloxacina, 5,5% à quinupristina-dalfopristina, 4% à linezolida e à penicilina, 3,5% à moxifloxacina, 3% à ampicilina e 2% à gentamicina. Todos os Enterococcus spp. isolados de alimentos foram sensíveis à teicoplanina e à tigeciclina. Entre os isolados clínicos, 67,5% apresentaram resistência à ciprofloxacina, 56,5% à penicilina, 43,5% à ampicilina, 37% à estreptomicina, 24% à vancomicina e à teicoplanina, e 11% à gentamicina. Cepas multirrestentes foram detectadas entre os isolados de alimentos e de amostras clínicas. Nos Enterococcus isolados de alimentos resistentes à tetraciclina foram detectados os genes tet M, tet L, tet K e tet C. Os genes ant6-Ia e aac(6')-Ie/aph(2")-Ia foram detectados em cepas de alimentos e de origem clínica. Com relação aos genes de virulência, entre os Enterococcus isolados de alimentos, 48% apresentaram o gene efaA, 42% o gelE, 37,5% o ace, 15% o as, 13% o esp e 11% o... / Abstract: Bacterial resistance to antibiotics is a major public health. In recent years there has often been the isolation of resistant bacteria from production and animal food animals. The aim of this study is to identify in Enterococcus spp. isolated from meat (pork, beef and chicken) and Frescal Minas cheese, susceptibility profile to antimicrobials and the diversity of antimicrobial resistance genes and virulence genes. The results are compared to the profile observed in Enterococcus spp. isolated from patients admitted to a tertiary hospital in São Paulo. One hundread two Enterococcus spp. were isolated from food and 46 were from clinical isolates. Resistances to different classes of antimicrobials has been observed, and among the isolates of food were resistant to tetracycline (39%), erythromycin (32%), Streptomycin (17.5%), norfloxacin (13%), chloramphenicol (10%), ciprofloxacin and fosfomycin (8%), levofloxacin (6%), quinupristin-dalfopristin (5.5%), penicillin and linezolid (4%), moxifloxacin (3.5%), ampicillin (3%) and gentamicin (2%). All Enterococcus spp. isolates from foods were sensitive to teicoplanin and tigecycline. Among clinical isolates, were resistant to ciprofloxacin (67.5%), penicillin (56.5%), ampicillin (43.5%), streptomycin (37%), vancomycin and teicoplanin (24%) and gentamicin (11%). Multidrug-resistant strains were detected among isolates from food and clinical samples. In Enterococcus spp. tetracycline resistant, the genes tet M, tet L, tet K and tet C were detected. The genes ant6-la and aac(6')-Ie/aph(2")-Ia were detected in strains of food and clinical origin. Regarding the virulence genes among Enterococcus isolates from food, 48% had the gene efaA, 42% the gelE, 37.5% the ace, 15% the as, 13% the esp and 11% the cyl. Among the clinical isolates, 61% had the ace, 56.5% the efaA, 43.5% the gelE, 11% the cyl and esp, and 6,5% the as. The hyl gene was ... / Doutor
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Riqueza e alterações morfofisiológicas associadas à infecção por vírus de RNA de fita dupla no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae / Richness and morphophysiological changes associated with infection by double-stranded RNA virus in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliaeSantos, Viviane 11 April 2013 (has links)
O Brasil é o país líder no uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae para o controle pragas agrícolas. Pouco se conhece sobre a diversidade e o impacto dos micovírus em M. anisopliae sensu stricto. Este trabalho mostra a riqueza dos micovírus associados a isolados de M. anisopliae da coleção de entomopatógenos da Universidade de São Paulo, usinas sucroalcooleiras e produtos microbianos à base do entomopatógeno. RNAfd foram encontrados em 55% dos 36 isolados de Metarhizium e apresentaram 16 diferentes padrões eletroforéticos consistindo de 3 a 18 bandas de RNAfd em gel de poliacrilamida. RNAfd não foram detectados em nenhum dos produtos comerciais utilizados no presente estudo. Os diferentes padrões de vírus encontrados nos isolados aqui estudados, aparentemente, não têm relação com os locais onde foram coletados. O inibidor de síntese protéica ciclohexamida não foi eficiente na eliminação dos vírus de RNAfd em nenhum dos isolados de fungos testados. Colônias dos isolados de M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 e M. anisopliae CTC F8 foram curadas por meio do cultivo monoconidial ou isolamento de ponta de hifas. Alguns segmentos do isolado M. anisopliae PL26 foram perdidos após o subcultivo de ponta das hifas. Colônias de M. anisopliae ESALQ PL26 obtidas por meio do cultivo monoconidial ou subcultivo de ponta de hifas apresentaram grande variabilidade morfológica, no entanto, essa variação não foi correlacionada com a presença de micovírus. Colônias isogênicas de M. anisopliae ESALQ 1256 mostraram diferenças no crescimento, na produção de conídios e na virulência, no entanto, essas diferenças não foram associadas à presença de RNAfd. Não foram observadas diferenças na tolerância aos raios ultravioleta e ao calor entre as colônias de M. anisopliae ESALQ 1256, com e sem vírus de RNAfd. Colônias oriundas de setores formados no isolado M. anisopliae PL26 produziram menor quantidade de conídios e apresentaram menor quantidade de vírus RNAfd em comparação com as colônias oriundas de outras regiões da colônias originais com características normais. A repicagem sucessiva dos isolados de M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 e CTC F15, infectados por diferentes vírus de RNAfd, nos meios de cultura BDA, SDAY e meio de arroz, bem como a passagem dos fungos em larvas de Tenebrio molitor, em geral, não afetaram a replicação dos micovírus. / Brazil is the leading country in the use of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against agricultural pests. Little is known about the diversity and the impact of mycovirus in M. anisopliae sensu stricto. This study shows the richness of mycovirus associated with M. anisopliae isolates from the collections of entomopathogens of the University of São Paulo, from sugar-alcohol factories and microbial based products. dsRNA were found in 55% of the 36 Metarhizium isolates and showed 16 different electrophoretic patterns consisting of 3 to 18 dsRNA bands in polyacrylamide gels. dsRNA was not detected in any of the commercial products used in this study. The different viral patterns found in the isolates studied here apparently have no relation to the locations where they were collected. The inhibitor of protein synthesis cycloheximide culture was efficient in eradicating dsRNA virus from fungi. Colonies of isolates of M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 and M. anisopliae F8 were cured by monoconidial or by hyphal tip isolation of. Some segments of the M. anisopliae PL26 isolate were lost following hyphal tip subculture. Colonies both from monoconidial culture and hyphal tip subculture of M. anisopliae ESALQ PL26 showed great morphological variability; however, this variation was not correlated with the presence of mycoviruses. Isogenic colonies of M. anisopliae ESALQ 1256 showed differences in growth, conidia production and virulence; however, these differences were not associated to the presence of the dsRNA. No difference was observed regarding tolerance to ultraviolet rays and heat among the colonies of M. anisopliae ESALQ 1256, with and without the dsRNA virus. Sectors formed in the isolate M. anisopliae PL26 produced a smaller number of conidia and fewer dsRNA virus in comparison to the original colonies with normal characteristics. The repeated subculture of isolates of M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 and CTC F15, infected by different virus of dsRNA, in the PDA, SDAY culture media and in rice, as well as the fungi passage in larvae of Tenebrio molitor, in general, did not affect the replication of the mycovirus.
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Tipagem de Enterococcus faecalis isolados de infecções endodônticas e sistêmicas e sua correlação com os genes de virulência. / Typing of Enterococcus faecalis isolated from endodontic and systemic infections and its correlation with the virulence genes.Penas, Pâmela Pontes 23 October 2013 (has links)
O presente estudo objetivou investigar a relação genética entre linhagens isoladas de infecções endodônticas e sistêmicas, bem como sua correlação com marcadores de virulência e resistência antimicrobiana. As linhagens genéticas de 40 isolados clínicos de E. faecalis foram determinadas por Multilocus sequence typing. Clusters virulentos foram investigados por PCR quanto à presença do polimorfismo do operon da cápsula, genes associados à virulênciae resistência antimicrobiana. A maioria dos isolados sistêmicos pertencia ao complexo clonal 2, eram produtores de cápsula e carregavam muitos genes de virulência/resistência. Por outro lado, isolados endodônticos apresentaram uma maior diversidade genética, eram em sua maioria não-capsulados e com poucos genes de virulência. Concluímos que isolados endodônticos de E. faecalis apresentaram um perfil genético e de virulência diferente dos clusters patogênicos de pacientes hospitalizados, provavelmente devido a especialização ao nicho de colonização conferida principalmente por regiões variáveis no genoma. / The aim of the present study was investigate the genetic relation between lineages isolated from endodontic and systemic infections, as well as its correlation with virulence markers and antibiotic resistance. The genetic lineages of 40 E. faecalis clinical isolates were determined by Multilocus sequence typing. Virulent clusters were investigated by PCR for the presence of capsule operon polymorphism, genes associated to virulence and antibiotic resistance. Most systemic isolates belonged to clonal complex 2, were capsule-producers and carried many virulence/resistance genes. On the other hand, endodontic isolates presented a greater genetic diversity, were mostly non-capsulated and carried few virulence genes. We conclude that endodontic isolates of E. faecalis showed a different genetic and virulence profile of pathogenic clusters of hospitalized patients, probably due to a specialized niche colonization conferred primarily by variable regions in the genome.
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Caracterização fenotípica e genotípica de Listeria monocytogenes isoladas de produtos cárneos crus comercializados no município de São Paulo / Genotypic and phenotypic characterization of Listeria monocytogenes isolated from refrigerated meat products marketed in the city of São PauloRowlands, Ruth Estela Gravato 03 December 2013 (has links)
Listeria monocytogenes é um importante patógeno de origem alimentar que causa listeriose, infecção severa que acomete, principalmente, gestantes, idosos, crianças e imunocomprometidos, e que apresenta elevada taxa de mortalidade. A bactéria está amplamente distribuída no ambiente e é comumente encontrada em produtos cárneos. O presente estudo teve como objetivos caracterizar 439 isolados de L. monocytogenes obtidos de salsicha bovina e produtos cárneos crus (carne moída, linguiça suína e coxa de frango) refrigerados, adquiridos no comércio do município de São Paulo, e previamente submetidos à sorotipagem molecular. Os isolados foram caracterizados quanto ao perfil de susceptibilidade antimicrobiana; presença dos genes de virulência actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB e mpl; perfil genético por eletroforese em campo pulsado (PFGE) e sequenciamento parcial dos genes actA e lmo0737. Baixa frequência de resistência antimicrobiana (0,5%) foi observada entre os 416 isolados avaliados. Um isolado pertencente ao sorogrupo 1 apresentou resistência à penicilina e à clindamicina e outro identificado como 4a ou 4c apresentou resistência à tetraciclina. Todos os isolados foram positivos para os genes de virulência testados. O sequenciamento parcial do gene actA mostrou a ocorrência de 14 sequências de nucleotídeos distintas nos 97 isolados avaliados. Além disso, verificou-se a ocorrência de uma deleção de 35 aminoácidos no gene actA em 36 isolados, além de substituições de nucleotídeos que resultaram em mutações nas sequências de aminoácidos da grande maioria dos isolados. A análise filogenética do gene actA possibilitou o agrupamento dos isolados em duas linhagens distintas (I e II). Os resultados do PFGE indicaram grande variabilidade nos perfis genéticos dos isolados analisados, principalmente naqueles pertencentes aos grupos 2 (1/2c e 3c), 3 (1/2b e 3b) e 4 (4b, 4d e 4e). Os resultados deste estudo mostram que os isolados de L. monocytogenes provenientes de salsicha bovina e produtos cárneos crus comercializados no município de São Paulo, apresentam grande diversidade genética, importante potencial de virulência e baixa frequência de resistência antimicrobiana. A diversidade observada deve-se, provavelmente, à característica ubíqua deste micro-organismo, tornando-o mais susceptível a grande pressão seletiva do ambiente. / Listeria monocytogenes is an important foodborne pathogen that causes listeriosis, a severe infection that affects primarily pregnant women, elderly, children and imunocompromised individuals, and has a high mortality rate. The bacteria is widely distributed in the environment and commonly found in meat products. The present study aimed to characterize 439 isolates of L. monocytogenes obtained from pork sausage and raw chilled meat products (ground beef, beef sausage, and chicken thigh) purchased in supermarkets in the city of São Paulo, and previously submitted to molecular serotyping. The isolates were characterized for antimicrobial susceptibility profile; presence of virulence genes actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB and mpl; genetic profile by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and partial sequencing of genes actA and lmo0737. A low frequency of antimicrobial resistance (0.5%) was observed among the 416 evaluated isolates. One isolate belonging to serogroup 1 presented resistance to clindamycin and penicillin and another one identified as 4a or 4c was resistant to tetracycline. All isolates were positive for the tested virulence genes. The partial sequencing of the gene actA indicated the occurrence of 14 distinct nucleotide sequences in the 97 isolates tested. Furthermore, a deletion of 35 amino acids in the actA gene was detected in 36 isolates, and nucleotide substitutions that resulted in amino acid changes in the sequences of most isolates. Phylogenetic analysis of the actA gene clustered the isolates in two distinct lineages (I and II). Results of PFGE indicated a great genetic variability among isolates, especially among those belonging to groups 2 (1/2c and 3c), 3 (1/2b and 3b) and 4 (4b, 4d and 4e). The results of this study show that isolates of L. monocytogenes from pork sausage and raw meat products marketed in the city of São Paulo present a great genetic diversity, significant virulence potential and low frequency of antimicrobial resistance. The detected diversity is probably due the ubiquitous nature of these microorganisms, making them more susceptible to selective pressure of the environment.
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Expressão dos genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 e EFG1 de Candida albicans em biofilmes após inativação fotodinâmica. / Expression of the Candida albicans genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 and EFG1 in biofilms after photodynamic inactivation.Freire, Fernanda [UNESP] 30 November 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-11-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os micro-organismos estão se tornando cada vez mais resistentes aos antimicrobianos e cepas de Candida albicans resistentes aos antifúngicos tem sido isoladas, assim, torna-se importante e necessário a realização de pesquisas que avaliem os efeitos de novos métodos terapêuticos, como a inativação fotodinâmica antimicrobiana (aPDI). Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da inativação fotodinâmica sobre biofilmes de Candida albicans, avaliando seus efeitos sobre a expressão dos genes TEC1 (fator de transcrição), HWP1 (proteína de parede celular das hifas), EFG1 (regulador transcricional relacionado com a morfogênese), BCR1 (regulador da formação de biofilme e da parede celular), CPH1 (regulador transcricional envolvido na morfogênese) e ALS3 (adesina) de C. albicans. Foram avaliadas 30 amostras isoladas de pacientes portadores de HIV e 30 amostras de pacientes com estomatite protética, quanto a produção de biofilme, peso seco e filamentação. Destas, foram selecionadas as amostras mais virulentas de cada grupo que apresentaram melhor capacidade de formação de biofilme e filamentação. Assim, foi utilizada uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente portador de HIV, uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente com estomatite protética e uma cepa padrão ATCC 18804. A quantificação da expressão dos genes foi relacionada à produção desses genes nas amostras clínicas e na cepa de referência utilizando-se ensaio de PCR em tempo real. Para a aPDI, foram utilizados os fotossensibilizadores azul de metileno a 300 μM e eritrosina a 400 μM sensibilizados com laser de Índio-Gálio-Alumínio-Fósforo de baixa potência (vermelho visível, 660 nm) e LED verde (532 ± 10 nm), respectivamente. Foram avaliados quatro grupos experimentais para a aPDI: a) F+L+: sensibilização com o corante e irradiação com luz; b) F+L-: somente tratamento com o fotossensibilizador; c) F-L+: somente irradiação com luz e d) F-L-: sem sensibilização com o corante e ausência de luz. Os resultados foram analisados por t-test, com um nível de significância de 5%. Após a análise fenotípica, as amostras Ca30 e 39S foram selecionadas para a realização da aPDI. Como esperado, apenas para o grupo F+L+, quando comparado com o grupo F-L-, todos os genes analisados foram sub expressos após a aPDI. O fold-decrease para os genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 e EFG1 foram 0,73; 0,39; 0,77; 0,71; 0,67 e 0,60; para laser, respectivamente, e 0,66; 0,61; 0,50; 0,43; 0,54 e 0,66; para LED, respectivamente. Pode-se concluir que a aPDI mostrou uma redução na expressão dos genes de C. albicans, sugerindo a diminuição de sua virulência. / Micro-organisms are becoming increasingly resistant to antimicrobial agents and Candida albicans resistant strains to antifungal has been isolated, so it is important and necessary to carry out studies that evaluates the effects of new therapeutic methods, such as antimicrobial photodynamic inactivation (aPDI). The objective of this study was verify the effects of aPDI on C. albicans biofilms, evaluating its effects on genes expression: TEC1 (transcription factor), HWP1 (cell wall protein hyphae), EFG1 (transcriptional regulator related to morphogenesis), BCR1 (regulator of biofilm formation and cell wall), CPH1 (transcriptional regulator involved in morphogenesis) and ALS3 (adhesin) of C. albicans. Were evaluated 30 samples isolated from patients with HIV and 30 samples from patients with denture stomatitis, as the production of biofilm, dry weight and filamentation. Of these, the most virulent strains of each group that presented better biofilm formation capacity and filamentation were selected. Therefore, were used a clinical sample of C. albicans isolated from HIV positive patient, a clinical sample of C. albicans isolated from patient with denture stomatitis and a standard strain ATCC 18804. The quantification of gene expression was related to the production of these genes in clinical samples and in the reference strain using PCR assay in real time. For aPDI, were used the photosensitizer methylene blue at 300 uM and erythrosine at 400 uM, sensitized with low power laser Indium-Gallium-AluminumPhosphorus (visible red, 660 nm) and green LED (532 ± 10 nm), respectively. Were evaluated four groups for aPDI: a) P+L+: sensitization with the photosensitizer and irradiation with light; b) P+L-: only treatment with the photosensitizer; c) P-L+: only irradiation with light and d) P-L-: without sensitization with the dye and absence of light. The results were analyzed by t-test, with a significance level of 5%. After the phenotypic analysis, the samples Ca30 and 39 S were selected for aPDI . As expected, only in the group P+L+ when compared with the group P-L-, all analyzed genes were downregulated after aPDI. The fold-decrease for the genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 and EFG1, were 0.73, 0.39, 0.77, 0.71, 0.67 and 0.60, for laser, respectively, and 0.66, 0.61, .050, 0.43, 0.54 and 0.66, for LED, respectively. It could be concluded that aPDI showed a reduction in the expression of C. albicans genes, suggesting its virulence decrease. / 2013/22897-2
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Efeito da concentração subinibitória de amoxicilina e ciprofloxacino sobre alguns fatores relacionados à virulência de Staphylococcus aureusAoki, Elisabeth Eyko [UNESP] 17 November 2008 (has links) (PDF)
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aoki_ee_dr_arafcf.pdf: 506585 bytes, checksum: 218b2c8e86bf9f798b9b0d4d716e2401 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O efeito de amoxicilina e ciprofloxacino, agentes antimicrobianos com diferentes mecanismos de ação, sobre alguns fatores relacionados à sua virulência em Staphylococcus aureus ATCC 25923 foi comparado. Efeito pós-antimicrobiano, atividade hemolítica para hemácias de carneiro, atividade de citolisinas extracelulares para células McCoy, susceptibilidade à fagocitose dependente e não dependente de opsonização, por neutrófilos de Rattus albinus norvegicus, foram avaliados em bactérias crescidas na presença de concentração subinibitória (½ CIM) do antimicrobiano e a capacidade de induzir estresse oxidativo foi determinada diretamente sobre as células bacterianas através da detecção da produção de ânion superóxido. Amoxicilina e ciprofloxacino demonstraram efeito sobre o crescimento de S. aureus estatisticamente significativo em relação ao controle, sendo maior para amoxicilina. A atividade hemolítica foi diminuída na presença de amoxicilina e ambos antimicrobianos induziram aumento na atividade de citolisinas extracelulares. A técnica de quimiluminescência dependente de luminol, utilizada para avaliar susceptibilidade à fagocitose através do burst oxidativo de polimorfonucleares neutrófilos, demonstrou que amoxicilina influenciou positivamente a fagocitose dependente de opsoninas e ciprofloxacino estimulou a fagocitose não opsonizada. Visto o burst oxidativo ser um método indireto para a demonstração de fagocitose, a confirmação de células bacterianas fagocitadas/aderidas foi realizada através da observação de esfregaços corados em microscopia ótica comum (1000 x). Apesar de ambos antimicrobianos induzirem aumento de ânion superóxido intracelular, detectado em ensaios de redução de nitroblue tetrazolium (NBT), o ciprofloxacino induziu maior quantidade que a amoxicilina. A demonstração de que diferentes antimicrobianos possam atuar sobre...( Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Amoxycillin and ciprofloxacin are antimicrobials with dissimilar mechanisms of action against bacteria. This is a comparative study of how each of these agents affects some of the factors related to the virulence of the pathogenic strain of Staphylococcus aureus ATCC 25923. The post-antibiotic effect, hemolytic activity against sheep erythrocytes, cytolysin activity against McCoy cells and susceptibility to opsonin-dependent and independent phagocytosis by neutrophils from Rattus albinus norvegicus were assessed in bacteria grown in a subinhibitory concentration (½ MIC) of each agent. Induction of oxidative stress was observed directly by detecting superoxide production in response to the bacteria. Both the antimicrobials exerted effect on the growth of S. aureus, which was significantly different from the growth of controls, though amoxycillin had the stronger effect. Hemolytic activity was diminished in the presence of amoxycillin, but both agents induced an increase in the activity of secreted cytolysins. By employing luminol-dependent chemiluminescence to assess the susceptibility of the bacteria to phagocytosis by detecting the respiratory burst in polymorphonuclear neutrophils, it was shown that amoxycillin had a positive effect on opsonin-dependent phagocytosis, while ciprofloxacin stimulated non-opsonized phagocytosis. Since detection of the respiratory burst is an indirect demonstration of phagocytosis, direct observation of stained slides under the light microscope at 1000 × magnification was used to confirm the presence of bacteria ingested by and adhering to neutrophils. While both agents induced a rise in the intracellular level of superoxide, assayed by nitroblue tetrazolium reduction, ciprofloxacin produced the stronger response. The demonstration that distinct antimicrobials... (Complete abstract click electronic access below)
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Detecção de genes associados à virulência em cepas de Campylobacter jejuni de origem aviária e humanaLima, Leonardo Moreira January 2016 (has links)
A demanda por carne de frango vem crescendo globalmente, assim como as exigências com relação à qualidade microbiológica do produto final. Associa-se a frequência de Campylobacter spp. em aves às enterites em humanos. O principal reservatório do agente é o trato digestivo de animais de diversas espécies, como aves de corte. Campylobacter spp. possui ampla diversidade genotípica e fenotípica, e apresentam diversos mecanismos de virulência para se aderir e colonizar o epitélio intestinal no hospedeiro. Apesar de o controle sanitário e biossegurança implementados nas granjas refletirem na redução de contaminação das carcaças no matadouro-frigorífico, esses procedimentos não eliminam o Campylobacter completamente das aves, podendo comprometer a qualidade microbiológica do produto final e propiciar casos de toxinfecção de origem alimentar aos consumidores. Esse trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência de seis genes de virulência de Campylobacter jejuni em amostras de carcaças de frango e em casos de campilobacteriose em humanos. Foram avaliadas 50 amostras de C. jejuni, das quais 25 eram de origem aviária, provenientes da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), e 25 eram de origem humana, cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos genes iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC e wlaN. Das amostras analisadas, 92% (23/25) de origem humana e 88% (22/25) de origem aviária foram positivas para o gene cdtB, 44% (11/25) de origem humana e 84% (21/25) de origem aviária para o gene cdtA; 20% (5/25) de origem humana e 80% (20/25) de origem aviária para o gene flaA; 48% (12/25) de origem humana e 76% (19/25) de origem aviária para o gene cdtC; 16% (4/25) de origem aviária para o gene wlaN e 12% (3/25) de origem humana e 4% (1/25) de origem aviária foram positivas para o gene iam. Em nenhuma das amostras pesquisadas de origem humana (0/25) foi observado o gene wlaN. Com este trabalho concluiu-se que os genes pesquisados podem estar presentes em cepas de C. jejuni provenientes de carne de frango e nas cepas isoladas de casos de infecção alimentar em humanos. Ainda assim, conforme os resultados apresentados, o gene cdtB teve maior frequência nas amostras provenientes de origem humana e aviária. / The demand for poultry meat has increased globally, as well as the microbiologic requirements of the final product. The frequency of Campylobacter spp. in poultry meat has been related to enteritis in humans. The digestive tract of several animals’ species, as poultries, is the main reservatory of the agent. Campylobacter spp. has a wide genotypic and phenotypic diversity, and, in addition to that, it presents several virulence factors which allow to adhere and colonize the intestinal epithelium of the host. Although good hygienic and biosecurity practices employed at poultry farms help to reduce the carcass contamination, these procedures do not completely eliminate Campylobacter spp. at the slaughterhouses and it may affect the microbiologic quality of the final product, which may cause alimentary toxinfection cases. This study aims to verify the occurrence of six virulence genes of Campylobacter jejuni from poultry carcasses samples and campylobacteriosis cases in humans. 50 samples of C. jejuni were evaluated, of which 25 were originated from poultry collected at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), and 25 were originated from human samples of the Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Polymerase chain reaction (PCR) technique was employed to detect the following genes: iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC and wlaN. In the samples analyzed, 92% (23/25) from human origin and 88% (22/25) from poultry for cdtB gene; 44% (11/25) from human origin and 84% (21/25) from poultry for cdtA gene; 20% (5/25) from human origin and 80% (20/25) from poultry for flaA gene; 48% (12/25) from human origin and 76% (19/25) from poultry for cdtC gene; 16% (4/25) from poultry for wlaN and gene 12% (3/25) from human origin and 4% (1/25) from poultry were positive for iam gene. This study concludes that the researched genes may be present in Campylobacter from poultry meat origin and from isolates of human cases of alimentary toxinfection. However, according to the results found, the cdtB gene had a higher frequency in samples of human and avian origin.
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Caracterização de transglicosilases líticas de mureína em xanthomonas citri subsp. citri 306 e estudo funcional das lts mltb2.1 e mltb2.2 associadas ao elemento Tnxax1 / Characterization of lytic murein transglycosylases in xanthomonas citri subsp. citri 306 and functional study of Tnxax1 element lts mltb2.1 and mltb2.2Oliveira, Amanda Carolina Paulino de [UNESP] 04 July 2018 (has links)
Submitted by Amanda Carolina Paulino de Oliveira (amanda@posgrad.fcav.unesp.br) on 2018-07-30T23:45:45Z
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Previous issue date: 2018-07-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) é o agente causal do cancro cítrico (CC), doença endêmica que afeta a citricultura. Durante a interação patógeno-hospedeiro o sistema de secreção tipo três (SST3) codificado pela XccA age na translocação de efetores e no estabelecimento da doença. A montagem do aparato de SST3 depende da síntese, remodelagem e degradação da parede celular bacteriana, sendo este processo realizado pela ação enzimática de transglicosilases líticas de mureína (LTs). XccA codifica diversas LTs, porém, pouco é conhecido sobre a diversidade de famílias e relação com a virulência. Dentre as LTs com provável relação com a virulência, duas ORFs parálogas presentes no cromossomo e plasmídeo pXAC64, respectivamente; são genes passageiros do TnXax1, um transposon da família Tn3, relacionado a evolução e emergência da patogenicidade nas Xanthomonadales. Portanto, este estudo objetivou elucidar o provável papel e diversidade das LTs presentes no genoma de XccA, caracterizando funcionalmente as LTs presentes em TnXax1 pela técnica de mutação sítio dirigida. Foram identificadas no genoma de XccA 13 LTs, sendo 12 pertencentes às famílias: 1A, 1B, 1C, 1D, 1F, 1G, 3A, 3B (2 cópias), 5A e 6A, e uma não classificada. A LT não classificada, é exclusiva do gênero Xanthomonas e relacionada à família 3B, porém contém um domínio adicional relacionado ao metabolismo de carboidratos. As LTs classificadas em famílias apresentam provável função relacionada com a remodelagem da parede celular para inserção de sistemas de secreção tipo 3, 4 e 6, inserção de flagelo, divisão celular, reciclagem da parede celular e degradação e controle da produção do peptidoglicano. As LTs do TnXax1 pertencem a família 3B, não são essenciais para XccA e desenvolvimento do CC, porém estão relacionadas ao aumento da virulência, diminuição da formação de biofilme, agregação e aumento na produção de goma xantana, corroborando o papel do TnXax1 como agente propagador da patogenicidade e virulência em Xanthomonadales. Em resumo, os resultados lançam novos conhecimentos frente ao papel das LTs com o metabolismo do peptidoglicano e relação com os mecanismos de transferência lateral, virulência e patogenicidade de XccA. / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) is a causal agent of type A citrus canker (CC), one of the most devastating citriculture diseases. Type 3 Secretion Systems (T3SS) play a fundamental role in XccA pathogenicity. T3SS components are embedded in the bacterial inner and outer membrane and act as a channel for injection of effector proteins directly into the plant host cell cytosol. T3SS assembly and installation relies on bacterial cell wall synthesis, remodeling and degradation. Murein lytic transglycosylases (LT) are important in this process and are responsible for peptidoglycan cleavage and its remodeling. Information about the XccA LT arsenal is scarce: little is known about family diversity, their exact role and their connection to virulence in this bacterium. Among the LTs with probable relation to virulence, two paralogue ORFs (one in chromosome, one in pXAC64 plasmid) are passenger genes of the Tn3 family transposon TnXax1, known to play a significant role for evolution and emergence of pathogenicity in Xanthomonadales. This study addresses LT diversity in the XccA genome and examines the role of plasmid and chromosomal TnXax1 LT passenger genes using site-directed deletion mutagenesis and functional characterization. We identified 13 XccA LTs: 12 belong to families 1A, 1B, 1C, 1D (2 copies), 1F, 1G, 3A, 3B (2 copies), 5A, 6A and one which is non-categorized. This noncategorized gene, is exclusive to the Xanthomonas genus and related to the 3B family but contains an additional domain linked to carbohydrate metabolism, whilst the other catalyzes peptidoglycan biosynthesis, and is widely distributed in gammaproteobacteria. The categorized LTs are probably involved in cell wall remodeling to allow insertion of type 3, 4 and 6 secretion systems, flagellum assembly, division and recycling of cell wall and degradation and control of peptidoglycan production. The TnXax1 passenger LTs (3B family) are not essential to XccA and CC development but are implicated in virulence, biofilm production and aggregation decrease and xanthan gum production increase, corroborating the role of TnXax1 transposon as a virulence and pathogenicity propagating agent in XccA. These findings also suggest that LTs acquisition by horizontal gene transfer mediated by TnXax1 improved bacterial fitness, bringing adaptive advantages to the plant-pathogen interaction process. / 33004102070P6
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Patogênese da leptospirose: estudo sobre os fatores envolvidos na virulência e disseminação do agente durante a infecção no modelo animal de hamster / Patogênese da leptospirose: estudo sobre os fatores envolvidos na virulência e disseminação do agente durante a infecção no modelo animal de hamsterWunder Júnior, Elsio Augusto January 2010 (has links)
Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T21:26:49Z
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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leptospirose é uma zoonose de importância global e um importante problema de
saúde pública principalmente em países em desenvolvimento. É causada por bactérias do
gênero Leptospira, uma espiroqueta móvel e de alta morbidade capaz de se disseminar nos
tecidos e causar doença crônica em animais hospedeiros. Uma barreira importante para o
controle e prevenção da doença tem sido o pouco conhecimento da patogênese do agente, em
parte pela falta de ferramentas disponíveis e eficazes de manipulação genética. Um dos
objetivos desse estudo foi caracterizar duas cepas mutantes de Leptospira interrogans. A
interrupção do gene lipl32, que codifica para a proteína LipL32, a mais abundante proteína no
gênero Leptospira e expressa somente na superfície das leptospiras patogênicas, foi realizada
através da inserção do transposon Himar1 no sorovar Manilae. A cepa mutante não
apresentou nenhuma diferença de crescimento ou de aderência em componentes da matriz
celular, comparada com a cepa parental. O mutante foi capaz de produzir doença aguda no
modelo animal de hamster e causar colonização crônica no modelo animal de rato, mostrando
que LipL32 não possui um papel nestes modelos de infecção. A interrupção do gene ligB foi
realizada com a utilização, pela primeira vez em leptospiras patogênicas, da técnica de
recombinação homóloga por mutagênese dirigida, onde o gene que codifica para a proteína
LigB teve uma parte substituída por um cassete de resistência de espectinomicina (Spcr). Essa
proteína, identificada como um possível fator de virulência, reconhecida pelo soro de
pacientes infectados e importante para a aderência em componentes da matriz celular,
mostrou não ser importante para a infecção aguda ou crônica, quando testada frente aos
modelos animais, além de não ser necessária para a aderência em cultura de células. Outro
objetivo desse trabalho foi estudar a cinética de disseminação da Leptospira interrogans no
modelo animal de hamster, utilizando uma dose alta (108 leptospiras) e baixa (250 leptospiras)
de inóculo, além de diferentes rotas de infecção. Nossos resultados demonstraram que
leptospiras se disseminam rapidamente em todos os tecidos 01 hora após a infecção com uma
alta dose de inóculo e que possivelmente a carga do agente nos tecidos é mais importante para
a patogênese do que a sua habilidade para a disseminação. Também demonstramos que a
motilidade não é essencial para disseminação, mas pode ser essencial para a carga nos tecidos
e letalidade. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis and a major public health problem especially
important in developing countries. Caused by bacteria of Leptospira genus, a motile lifethreatening
spirochete which is able to disseminate to tissues and causes chronic carriage in
animal hosts. A significant barrier to the control and prevention of leptospirosis has been the
limited understanding of its pathogenesis, due in part to the lack of tools available for the
genetic manipulation of this pathogen. One of the purposes of this study was to characterize
two mutant strains of Leptospira interrogans. Interruption of lipL32 gene, encoding LipL32,
the most abundant protein of pathogenic leptospires and its major outermembrane lipoprotein,
was achieved in serovar Manilae using transposon mutagenesis with Himar1. The mutant had
normal morphology and growth rate compared to the wild type and was equally adherent to
extracellular matrix. The mutant was able to cause acute severe disease manifestations in the
hamster model and chronic colonization in the rat model, showing that LipL32 doesn’t play a
role in neither of those models of infection. Interruption of ligB gene was achieved using the
homologous recombination by target mutagenesis for the first time in pathogenic leptospires
and a spectinomycin resistance (Spcr) gene replaced a portion of the ligB coding sequence.
This Lig protein, previously identified as a putative virulence factor, recognized by the sera of
infected patients and important for the adherence in extracellular matrix components, showed
not to be important for acute or chronic infection when tested with animal models and it’s not
required to mediate bacterial adherence to cultured cells. Another purpose of this study was to
determine and analyze the kinetics of dissemination of Leptospira interrogans in the hamster
model, using a high (108 leptospires) and low (250 leptospires) dose of inoculum and different
routes of infection. Our results demonstrated that leptospires can rapidly disseminate through
all tissues after 1 hour post-challenge with a high inoculum dose and that perhaps the load of
the agent in target tissues is more important for pathogenesis than its ability for dissemination.
We also demonstrate that motility is not essential for dissemination but can be essential for
tissue load and lethality.
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Avaliação da associação entre expressão da proteína “Kinetoplastid Membrane Protein-11” (KMP-11) e virulência de Leishmania amazonensisSantos, Elisangela Madureira dos January 2011 (has links)
Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-26T17:19:21Z
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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As leishmanioses formam um grupo de doenças que afetam 350 milhões de pessoas
atualmente, atingindo 88 países em todo o mundo com uma estimativa de 1-2 milhões de
novos casos por ano. O desfecho da infecção causada por Leishmania depende tanto de
fatores do patógeno como do hospedeiro, embora a virulência de Leishmania possa ser
modulada por fatores ambientais e genéticos relacionados aos hospedeiros mamíferos e
vetores, os determinantes moleculares são elementos-chave no estabelecimento da infecção,
ou seja, são os fatores que determinam a virulência. A KMP-11 é uma glicoproteína que está
presente em todos os cinetoplastideos. O presente estudo avaliou a expressão do gene de
KMP-11 de L. amazonensis ao nível de RNA e ao nível de proteína, durante passagens
sucessivas de promastigotas de fase estacionária através de cultivo in vitro, investigando se há
associação entre a sua expressão e a virulência dos parasitos. A avaliação da virulência dos
parasitos mantidos em cultura foi realizada através do acompanhamento da evolução da
infecção experimental murina (modelo in vivo) durante um período de dez semanas,
juntamente com a observação do surgimento de ulceração. A quantificação da carga
parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes das lesões, através da através da técnica de
diluição limitante A avaliação também foi realizada pela infecção de macrófagos murinos
(modelo in vitro). Os resultados de medição de pata foram analisados pelo teste não
paramétrico ANOVA 2 fatores, seguido do pós-teste de Bonferroni. Além disso, foi realizada
a determinação da proporção de metacíclicas nos promastigotas de fase estacionária mantidos
em cultura, através da técnica de lise pelo complemento. Nossos resultados mostraram que há
um decréscimo da virulência dos promastigotas de fase estacionária ao longo do número de
passagens, pois os camundongos infectados com as passagens iniciais desenvolveram lesões
maiores do que aqueles com os promastigotas mantidos em cultura por mais tempo. Quanto
ao surgimento de ulcerações, na 10a semana pós-infecção, todos os animais infectados com
promastigotas de 1a passagem apresentavam lesões ulceradas, enquanto que nenhum dos
camundongos infectados com promastigotas de 20a passagem apresentava lesão ulcerada. Na
infecção in vitro, a carga parasitária nos macrófagos testados diminuiu em função do número
das subculturas, o que foi demonstrado através do decréscimo da porcentagem média de
macrófagos infectados e pela quantidade média de amastigotas a cada 100 macrófagos
infectados. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes da
lesão dos camundongos infectados, confirmando a diminuição da virulência dos
promastigotas. A quantificação da proporção de promastigotas metacíclicas demonstrou que a
porcentagem diminui ao longo do tempo de subcultivo. A avaliação da expressão de KMP-11
na superfície de promastigotas por citometria de fluxo demonstrou um decréscimo na
expressão da proteína proporcional ao número de subculturas. Verificou-se, portanto, uma
associação entre a expressão da proteína KMP-11 e a virulência de promastigotas de L.
amazonensis. Os resultados dos ensaios de PCR em tempo real demonstraram que não há
diferença estatisticamente significativa na quantidade de transcritos do gene da proteína
KMP-11 entre as passagens analisadas. Entretanto, a perda da virulência associada com a
diminuição da expressão da proteína KMP-11 indica que esta molécula possua uma função na
infectividade dos promastigotas de Leishmania amazonensis, atuando possivelmente como
um fator de virulência. / The leishmaniases are a group of diseases that currently, affects 350 million people reaching
88 countries throughout world with an estimated incidence of 1-2 million new cases per year.
The outcome of the infection caused by Leishmania depends on factors from the pathogen and
from the host. Although Leishmania virulence can be modulated by environmental and
genetic factors related to mammalian hosts and vectors, molecular determinants are key
elements in the establishment of infection and for the determination, of virulence. KMP-11 is
a glycoprotein which is present in all kinetoplastids. This study evaluated the gene expression
of KMP-11 in L. amazonensis at RNA level and at protein level, during successive passages
of in vitro culture, investigating a possible correlation between KMP-11 expression and
virulence of parasites. The evaluation of the virulence of cultured parasites was performed by
monitoring of the progression of the lesions in experimental murine infection (in vivo model)
during ten weeks, along with the emergence of cutaneous ulcers. The quantification of
parasite load was performed on draining lymph nodes using the limiting dilution analysis. The
assessment of parasite virulence was also performed by the infection of murine macrophages
(in vitro model). The paw measurement results were analyzed by nonparametric test ANOVA
2 way, followed by Bonferroni post-test. Furthermore, the metacyclic promastigotes
proportion in stationary growth phase from cultures with different numbers of passages was
evaluated by complement lysis. Our results showed a decrease in promastigotes of stationary
phase virulence that correlated with the increase of the number of passages, as mice infected
with the early passages developed larger lesions than those infected with promastigotes
cultured for longer periods and higher numbers of passages. Concerning the development of
ulcers, at 10th week post-infection, all animals infected with promastigotes of first passage
presented ulcerated lesions, whereas none of the mice infected mice with promastigotes of the
20th passage showed an ulcerated lesion. Analyzing the in vitro infection, the parasite burden
in macrophages decreased with the number of subcultures, as demonstrated by the decrease in
the percentage of infected macrophages and in the number of amastigotes per 100 infected
macrophages. The quantification of parasites in draining lymph nodes of the infected mice
confirmed the decrease in the virulence of promastigotes from cultures with more passages.
The estimation of the metacyclic promastigote proportions showed that the percentages
decline through the time of subculture. The evaluation of KMP-11 expression on the surface
of promastigotes by flow cytometry showed a decrease in protein expression proportional to the number of subcultures. Therefore, there was an association between the expression of KMP-11 protein and the virulence of L. amazonensis promastigotes. The results of real-time
PCR assays showed that there is no statistically significant difference in the amount of gene
transcripts of KMP-11 protein in the analyzed passages. However, the loss of virulence
associated with decreased protein expression of KMP-11 indicates that this molecule may
have a role in promastigotes infectivity of Leishmania amazonensis, possibly acting as a
virulence factor.
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