Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-01Bitstream added on 2014-06-13T19:58:15Z : No. of bitstreams: 1 cezar_ma_me_botfca.pdf: 763015 bytes, checksum: ee0660882c5afc5f1bb0880fde94205f (MD5) / O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados de tobamovírus coletados em campos de produção comercial de pimentão e pimenta nas regiões de Lins, Sorocaba e Salto, Estado de São Paulo. A coleção de isolados foi submetida a testes sorológicos utilizando-se antissoros policlonais para o ToMV e PMMoV e em seguida à purificação biológica por meio de lesões monolesionais em Nicotiana glutinosa, onde algumas das lesões foram transferidas para Nicotiana cleevelandi, hospedeira multiplicadora de tobamovírus. Os isolados foram mantidos em plantas de Nicotiana cleevelandi por meio de sucessivas passagens mecânicas. Os isolados foram inoculados em uma série diferencial de Capsicum spp: C. annuum cv. ECW (L+L+); C. annuum cv. Magda (L+L+); C. annuum cv. Tisana (L1L1); C. frutescens cv. Tabasco (L2L2); C. chinense PI 159236 (L3 L3); C. chacoense PI 260429 (L4L4). Foram inoculados três plantas de cada genótipo diferencial no estádio de primeira folha verdadeira e estas avaliadas durante 21 dias. Realizou-se a identificação molecular destes isolados utilizando-se oligonucleotídeos universais e específicos para as espécies de TMV, ToMV e PMMoV em reação de RT-PCR de uma só etapa, utilizando-se a transcriptase reversa AMV e a Taq DNA polimerase. A especificidade dos oligonucleotídeos foi inicialmente avaliada por meio de comparação da seqüência nucleotídica dos oligonucleotídeos com a do genoma de espécies de tobamovírus disponíveis no Genbank.O teste biológico confirmou a presença de tobamovírus nas amostras coletadas a partir de pimentão e pimenta, entretanto não permitiu diferenciar as espécies de vírus presentes. De acordo com os resultados obtidos através da inoculação dos isolados em genótipos diferenciais, observou-se que os isolados Pe-01, Pe-03, Pe-05 e Pe-12... . / The objective of this work was to characterize virus isolates belonging to the Tobamovirus genus collected from commercial sweet and hot peppers fields surrounding the cities of Lins, Sorocaba and Salto, São Paulo State. The collection of isolates was subjected to serological detection using ToMV and PMMoV antisserums, followed by single local lesion passages in Nicotiana glutinosa. Some of the local lesion isolates were selected and inoculated in Nicotiana cleevelandi plants, a propagative host of tobamoviruses. The isolates were maintained in Nicotiana cleevelandi plants through successive sap-inoculations. These isolates were further inoculated on the differential genotypes of Capsicum spp: C. annuum cv. ECW (L+L+); C. annuum cv. Magda (L+L+); C. annuum cv. Tisana (L1L1); C. frutescens cv. Tabasco (L2L2); C. chinense PI 159236 (L3 L3); C. chacoense PI 260429 (L4L4). Three plants of each differential genotypes were inoculated at the first leaf stage, and evaluated during 21 days. The same isolates were submitted to the molecular identification using degenerated and specific primers for the TMV, ToMV and PMMoV species, in a one step RTPCR protocol, using the AMV reverse transcriptase and the Taq DNA polymerase. The specificity of the primers where first evaluated by a nucleotide sequence alignment of the primers with the sequence of the genome of tobamovirus disposable in the Genbank. The biological test has confirmed the presence of tobamovirus in the sweet pepper and hot pepper samples, but could not differentiate the species of virus. Using the differential genotypes of Capsicum spp, the isolates Pe-01, Pe-03, Pe-05 andPe-12 could be classified as belonging to the P1-2 pathotype. The isolate Pe-08 belongs to the P1 and Pe-02, Pe-04, Pe-06, Pe-07, Pe-09, Pe-10, Pe-11 and Pe-13 as P0 pathotype. By the RT-PCR the isolates Pe-06, Pe-07, Pe-09, Pe-10... (Complete abstract, click electronic address below).

Orientador: Renate Krause Sakate / Resumo: O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados de tobamovírus coletados em campos de produção comercial de pimentão e pimenta nas regiões de Lins, Sorocaba e Salto, Estado de São Paulo. A coleção de isolados foi submetida a testes sorológicos utilizando-se antissoros policlonais para o ToMV e PMMoV e em seguida à purificação biológica por meio de lesões monolesionais em Nicotiana glutinosa, onde algumas das lesões foram transferidas para Nicotiana cleevelandi, hospedeira multiplicadora de tobamovírus. Os isolados foram mantidos em plantas de Nicotiana cleevelandi por meio de sucessivas passagens mecânicas. Os isolados foram inoculados em uma série diferencial de Capsicum spp: C. annuum cv. ECW (L+L+); C. annuum cv. Magda (L+L+); C. annuum cv. Tisana (L1L1); C. frutescens cv. Tabasco (L2L2); C. chinense PI 159236 (L3 L3); C. chacoense PI 260429 (L4L4). Foram inoculados três plantas de cada genótipo diferencial no estádio de primeira folha verdadeira e estas avaliadas durante 21 dias. Realizou-se a identificação molecular destes isolados utilizando-se oligonucleotídeos universais e específicos para as espécies de TMV, ToMV e PMMoV em reação de RT-PCR de uma só etapa, utilizando-se a transcriptase reversa AMV e a Taq DNA polimerase. A especificidade dos oligonucleotídeos foi inicialmente avaliada por meio de comparação da seqüência nucleotídica dos oligonucleotídeos com a do genoma de espécies de tobamovírus disponíveis no Genbank.O teste biológico confirmou a presença de tobamovírus nas amostras coletadas a partir de pimentão e pimenta, entretanto não permitiu diferenciar as espécies de vírus presentes. De acordo com os resultados obtidos através da inoculação dos isolados em genótipos diferenciais, observou-se que os isolados Pe-01, Pe-03, Pe-05 e Pe-12... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The objective of this work was to characterize virus isolates belonging to the Tobamovirus genus collected from commercial sweet and hot peppers fields surrounding the cities of Lins, Sorocaba and Salto, São Paulo State. The collection of isolates was subjected to serological detection using ToMV and PMMoV antisserums, followed by single local lesion passages in Nicotiana glutinosa. Some of the local lesion isolates were selected and inoculated in Nicotiana cleevelandi plants, a propagative host of tobamoviruses. The isolates were maintained in Nicotiana cleevelandi plants through successive sap-inoculations. These isolates were further inoculated on the differential genotypes of Capsicum spp: C. annuum cv. ECW (L+L+); C. annuum cv. Magda (L+L+); C. annuum cv. Tisana (L1L1); C. frutescens cv. Tabasco (L2L2); C. chinense PI 159236 (L3 L3); C. chacoense PI 260429 (L4L4). Three plants of each differential genotypes were inoculated at the first leaf stage, and evaluated during 21 days. The same isolates were submitted to the molecular identification using degenerated and specific primers for the TMV, ToMV and PMMoV species, in a one step RTPCR protocol, using the AMV reverse transcriptase and the Taq DNA polymerase. The specificity of the primers where first evaluated by a nucleotide sequence alignment of the primers with the sequence of the genome of tobamovirus disposable in the Genbank. The biological test has confirmed the presence of tobamovirus in the sweet pepper and hot pepper samples, but could not differentiate the species of virus. Using the differential genotypes of Capsicum spp, the isolates Pe-01, Pe-03, Pe-05 andPe-12 could be classified as belonging to the P1-2 pathotype. The isolate Pe-08 belongs to the P1 and Pe-02, Pe-04, Pe-06, Pe-07, Pe-09, Pe-10, Pe-11 and Pe-13 as P0 pathotype. By the RT-PCR the isolates Pe-06, Pe-07, Pe-09, Pe-10... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001-12Bitstream added on 2014-06-13T19:37:31Z : No. of bitstreams: 1 frangioni_dss_me_botfca.pdf: 542597 bytes, checksum: 287866285220c5f30edfb16af2d32683 (MD5) / No período de 1998 à 2001, 17 amostras de pimentão ‘Magali-R’ (Capsicum annuum L.) com sintomas de mosaico sistêmico, nanismo, deformação foliar e dos frutos, causando severos danos e perdas econômicas, foram coletadas nas regiões produtoras de Paulínia, Lins, Jacareí, Guaiçara e Lucianópolis, municípios do Estado de São Paulo. Essas amostras foram caracterizadas através de círculo de hospedeiras, DAS-ELISA com o emprego de anticorpo monoclonal contra o CMV-I e CMV-II. Um isolado de cada região foi caracterizado molecularmente, quanto ao subgrupo através da RT-PCR e RFLP com a endonuclease de restrição MspI. As amostras foram inoculadas em plantas indicadoras que reagiram com sintomas típicos do Cucumber mosaic virus (CMV), entre estas, Nicotiana glutinosa demonstrando mosaico sistêmico e ausência de necrose, indicou que os isolados do CMV, em estudo, pertenciam ao subgrupo I. N. glutinosa foi utilizada para manter os isolados, para os testes de ELISA, extração de RNA total e como multiplicadora do vírus para a purificação. Todos os isolados testados no DAS-ELISA reagiram positivamente ao anticorpo monoclonal específico para o CMV-I e negativamente para o CMV-II. Os isolados 1, 3, 4, 15 e 17 foram amplificados com sucesso através da RT-PCR, e produziram um fragmento de 486 pb, tamanho esperado para o subgrupo I. Fragmento que ao ser digerido pela MspI, resultou em duas bandas de 150 e 336 pb, padrão esperado para o CMV-I. O método utilizado na purificação foi eficiente, resultando em uma preparação do CMV purificado, cujo rendimento foi de 40 mg/kg de tecido infectado, permitindo a imunização de galinhas e a produção de um antissoro policlonal específico à partir das gemas dos ovos. O antissoro apresentou alto título em ELISA indireto. A triagem de genótipos de pimentão para a resistência ao CMV... . / During the years 1998 to 2001, 17 samples of sweet peppers ‘Magali- R’ (Capsicum annuum L.) showing systemic mosaic, stunt, leaf and fruit distortion, causing severe damage and economic losses, were collected from Paulínia, Lins, Jacareí, Guaiçara and Lucianópolis, regions of São Paulo State. These samples were characterized by host range and DAS-ELISA with monoclonal antibodies against CMV I and CMV II. One isolate from each region was also characterized by RT-PCR and RFLP with restriction enzyme MspI. The plants host range revelead the presence of the Cucumber mosaic virus (CMV) in all samples. The symptom reaction in Nicotiana glutinosa was sistemic mosaic without necrosis, indicating that all CMV isolates belongs to subgroup I. The CMV isolates were also propagated and mantained in this host for the ELISA test and total RNA extration. All isolates tested by DAS-ELISA reacted positively with CMV I specific monoclonal antibodies and negatively with CMV II. The isolates 1, 3, 4, 15 e 17 were successfully amplified by the RTPCR and produced a fragment of 486 pb, the expected size for CMV subgroup I. These fragments when digested by MspI produced two bands of 150 and 336 pb, restriction pattern expected for the CMV subgroup I. Purified CMV yielding was 40mg/kg of infected leaves. The method used was efficient to produce a good purified preparation utilized to immunize chickens that produced specific antiserum with high titer. Screening of sweet peppers resistance to CMV showed immunity of AF-97A and tolerance of AF-188, AF-1178, AF-98 A, AF-99 A and AF-136 A. The hybrid progenies Lamuyo, Reinger, Mayata, Mônica, Magali, Mikalor, Esterel, Melody and “All Big” cultivar showed immune plants. These results are promising to sweet pepper breeding for resistance to CMV.

Resumo: No período de 1998 à 2001, 17 amostras de pimentão 'Magali-R' (Capsicum annuum L.) com sintomas de mosaico sistêmico, nanismo, deformação foliar e dos frutos, causando severos danos e perdas econômicas, foram coletadas nas regiões produtoras de Paulínia, Lins, Jacareí, Guaiçara e Lucianópolis, municípios do Estado de São Paulo. Essas amostras foram caracterizadas através de círculo de hospedeiras, DAS-ELISA com o emprego de anticorpo monoclonal contra o CMV-I e CMV-II. Um isolado de cada região foi caracterizado molecularmente, quanto ao subgrupo através da RT-PCR e RFLP com a endonuclease de restrição MspI. As amostras foram inoculadas em plantas indicadoras que reagiram com sintomas típicos do Cucumber mosaic virus (CMV), entre estas, Nicotiana glutinosa demonstrando mosaico sistêmico e ausência de necrose, indicou que os isolados do CMV, em estudo, pertenciam ao subgrupo I. N. glutinosa foi utilizada para manter os isolados, para os testes de ELISA, extração de RNA total e como multiplicadora do vírus para a purificação. Todos os isolados testados no DAS-ELISA reagiram positivamente ao anticorpo monoclonal específico para o CMV-I e negativamente para o CMV-II. Os isolados 1, 3, 4, 15 e 17 foram amplificados com sucesso através da RT-PCR, e produziram um fragmento de 486 pb, tamanho esperado para o subgrupo I. Fragmento que ao ser digerido pela MspI, resultou em duas bandas de 150 e 336 pb, padrão esperado para o CMV-I. O método utilizado na purificação foi eficiente, resultando em uma preparação do CMV purificado, cujo rendimento foi de 40 mg/kg de tecido infectado, permitindo a imunização de galinhas e a produção de um antissoro policlonal específico à partir das gemas dos ovos. O antissoro apresentou alto título em ELISA indireto. A triagem de genótipos de pimentão para a resistência ao CMV... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: During the years 1998 to 2001, 17 samples of sweet peppers 'Magali- R' (Capsicum annuum L.) showing systemic mosaic, stunt, leaf and fruit distortion, causing severe damage and economic losses, were collected from Paulínia, Lins, Jacareí, Guaiçara and Lucianópolis, regions of São Paulo State. These samples were characterized by host range and DAS-ELISA with monoclonal antibodies against CMV I and CMV II. One isolate from each region was also characterized by RT-PCR and RFLP with restriction enzyme MspI. The plants host range revelead the presence of the Cucumber mosaic virus (CMV) in all samples. The symptom reaction in Nicotiana glutinosa was sistemic mosaic without necrosis, indicating that all CMV isolates belongs to subgroup I. The CMV isolates were also propagated and mantained in this host for the ELISA test and total RNA extration. All isolates tested by DAS-ELISA reacted positively with CMV I specific monoclonal antibodies and negatively with CMV II. The isolates 1, 3, 4, 15 e 17 were successfully amplified by the RTPCR and produced a fragment of 486 pb, the expected size for CMV subgroup I. These fragments when digested by MspI produced two bands of 150 and 336 pb, restriction pattern expected for the CMV subgroup I. Purified CMV yielding was 40mg/kg of infected leaves. The method used was efficient to produce a good purified preparation utilized to immunize chickens that produced specific antiserum with high titer. Screening of sweet peppers resistance to CMV showed immunity of AF-97A and tolerance of AF-188, AF-1178, AF-98 A, AF-99 A and AF-136 A. The hybrid progenies Lamuyo, Reinger, Mayata, Mônica, Magali, Mikalor, Esterel, Melody and "All Big" cultivar showed immune plants. These results are promising to sweet pepper breeding for resistance to CMV. / Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Addolarata Colariccio / Mestre

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Juliana de Freitas Astúa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T08:50:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kubo_KarenSumire_D.pdf: 11235043 bytes, checksum: fb3c7d7e7af4e5fc35ef4a27c3364fda (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O Citrus leprosis virus C (CiLV-C) é o agente causal da leprose dos citros, uma doença incomum transmitida pelo ácaro Brevipalpus phoenicis. Uma vez que o CiLV-C permanece confinado em lesões localizadas nas folhas, ramos e frutos sem causar infecção sistêmica, o vetor precisa se alimentar nestas lesões para adquirir o vírus. O objetivo deste trabalho foi analisar os perfis de expressão diferencial entre um genótipo resistente (tangor 'Murcott') e um suscetível (laranja 'Pera') em resposta à leprose dos citros e identificar os possíveis mecanismos de resistência envolvidos na resistência à doença. Por esse motivo, antes da instalação dos experimentos biológicos, nós aperfeiçoamos a detecção do CiLV-C em seu vetor, para certificação da aquisição viral. O experimento biológico incluiu quatro grupos: genótipo resistente ou suscetível infestados com ácaros virulíferos ou avirulíferos para CiLV-C. Com o intuito de se identificar genes diferencialmente expressos, nós utilizamos lâminas de microarranjo com sondas baseadas na base de dados do Citrus EST (CitEST). As análises estatísticas foram realizadas por two-way ANOVA considerando os fatores genótipo e a infecção pelo CiLV-C, de maneira a se encontrar respostas envolvidas na resistência ao CiLV-C. Os resultados foram interpretados por Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Os resultados sugerem que existem receptor-like proteins (RLP) e receptor-like kinase (RLK) que podem reconhecer o vírus ou o ácaro, ativando uma resposta de defesa baseada na assinatura de 'Ca POT.2+' e ativação da via do ácido salicílico. Estudos adicionais ainda são necessários para verificar se a resposta de defesa pode estar relacionada à resistência sistêmica adquirida (SAR) / Abstract: Citrus leprosis virus C (CiLV-C) is the causal agent of citrus leprosis, an unusual disease transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis. Since CiLV-C remains confined in localized lesions in leaves, stems and fruits without causing systemic infection, the vector needs to feed in these lesions to acquire the virus. The aim of this work was to analyze the differential gene expression profiles between resistant ('Murcott' tangor) and susceptible ('Pera' sweet orange) citrus genotypes in response to CiLV-C, and to identify possible mechanisms involved in disease resistance. For this reason, before the biological experiments were set, we improved the detection of CiLV-C in the mite vector to ensure virus acquisition. The biological experiment consisted in four groups: susceptible or resistant genotype infested with CiLV-C viruliferous or nonviruliferous mites. In order to identify differentially expressed genes, we used microarray chips designed using the Citrus EST database (CitEST). The statistical analysis was performed by two-way ANOVA considering the genotype and the infection by CiLV-C, aiming to find defense responses against CiLV-C. The results were interpreted by Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) and led to the hypothesis that receptor-like proteins (RLP) and receptor-like kinase (RLK) may recognize the virus or the mite triggering a defense response based on 'Ca POT.2+' signature and activation of Salicylic acid pathway (SA). Further studies are necessary to evaluate if the defense response could be related to the development of systemic acquired resistance (SAR) / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular