Les douleurs viscérales chroniques font partie des effets secondaires des patients traités pour des cancers de la zone pelvienne. Ces douleurs peuvent affecter grandement la qualité de vie de ces patients. Dans les cas les plus graves, il n'existe pas de traitement analgésique efficace. Ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces constitue un enjeu majeur. Au sein de notre laboratoire, le potentiel réparateur et immuno-modulateur des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) a déjà été démontré dans un modèle d'ulcération colorectale radio-induite chez le rat. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'évaluer d'abord la pertinence de l'utilisation de ce modèle pour l'étude de l'hypersensibilité viscérale persistante radio-induite, puis, le bénéfice thérapeutique de l'utilisation des CSM comme agent antinociceptif. Nous avons dans un premier temps démontré, dans ce modèle, le maintien au cours du temps d'une hypersensibilité viscérale associée à une sensibilisation centrale persistante après irradiation, validant ainsi le modèle. Nous avons ensuite montré l'implication des mastocytes (MC) et suggéré l'implication du neuromédiateur NO dans les mécanismes de la sensibilisation périphérique sous-tendant une telle hypersensibilité. Nous avons enfin mis en évidence que le traitement par des CSM permettait la réduction de l'hypersensibilité viscérale radio-induite persistante. La capacité des CSM à moduler l'activation des MC et/ou leurs interactions avec les fibres nerveuses pourrait être impliquée dans leur action antinociceptive. En conclusion, ce travail a permis d'élargir le spectre d'action thérapeutique des CSM dans notre modèle d'étude. / Patients who undergo pelvic radiotherapy may develop significant incidence of undesirable chronic gastrointestinal complications resulting from radiation-induced damages around the tumour. Chronic visceral pain is one of the radiation-induced side effects that greatly affects the quality of life of “cancer survivors”. The lack of effective analgesic treatment highlights the importance of novel and effective therapeutic strategies. In our laboratory, mesenchymal stromal cell (MSC) based approach showed beneficial immunomodulatory and regenerative effects in a rat model of irreversible radiation-induced colonic ulcers. The goal of my work was to assess the relevance of this model to study radiation-induced visceral persistent hypersensitivity and its modulation by MSC treatment. We first demonstrated that this model is associated with long-lasting visceral hypersensitivity and central neuronal sensitization. In this context we showed then that mast cells (MC) are involved in the mechanism of peripheral sensitization. Moreover, we suggested the implication of the neuromediator NO• in the pathophysiology of persistent radiation-induced visceral hypersensitivity. We also suggested that MSC treatment reversed radiation-induced hypersensitivity by a mechanism that in part may involve the modulation of MC activation and/or the decrease in the number of MC and nerve fiber interactions. In addition, MSC treatment reduced the percentage of nitrinergic neurons, increased after irradiation, and restored colonic muscular contractibility. Such processes may promote the therapeutic benefit of MSC observed in our study. In conclusion, this work provided new insights on the therapeutic benefit of MSC in our study model and a new argument in favour of their use in a future clinical trial to cure abdominopelvic radiotherapy side effects.

Le Syndrome de l'Intestin Irritable (SII) est caractérisé par des douleurs abdominales chroniques, des diarrhées, des constipations ou l'alternance des deux. Les neurones sensitifs des patients seraient surexcitables et ainsi à l'origine de l'hypersensibilité viscérale ressentie. Parmi les médiateurs impliqués dans le SII, les protéases ont un rôle prépondérant notamment car il a été observé une augmentation de leur activité dans des surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII. Ces protéases sont capables d'activer les " Protease-Activated Receptors " (PARs) dans les neurones sensitifs de souris. L'activation des neurones sensitifs murins peut être déclenchée selon un mécanisme dépendant de PAR2 et générant une hypersensibilité viscérale, mais inhibée par un mécanisme dépendant de PAR4. Dans certaines cellules (plaquettes), les PARs ont des rôles très différents entre la souris et l'homme. L'expression et la signalisation des PARs dans les neurones sensitifs humains étant jusqu'alors inconnues, cette thèse a eu pour objectif général d'étudier la signalisation des PARs et d'identifier les effets de médiateurs présents dans les tissus de patients atteints du SII, sur leur capacité à activer des neurones sensitifs humains. Le but ultime était d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII chez l'homme. Le premier objectif a été de mettre au point la culture de neurones humains des ganglions spinaux dorsaux (GSD) thoraciques, contenant des projections coliques de neurones sensitifs. Une culture de neurones sensitifs d'une pureté de 90% a été obtenue, ces neurones étaient viables et fonctionnels, mobilisant du calcium intracellulaire en réponse à différents agonistes pro-nociceptifs. L'expression des PARs a été étudiée dans ces cultures et comparée à celle dans des tissus de GSD frais. PAR1, PAR2 et PAR4 de même que d'autres récepteurs canaux de la famille des " Transcient Receptors Potential " (TRPs) étaient exprimés de façon comparable dans les GSD fraichement isolés et dans les cultures de neurones, validant ainsi le phénotype physiologique des neurones en culture. L'effet des agonistes des PARs a ensuite été étudié sur la signalisation calcique dans ces cultures de neurones sensitifs humains. De tous les agonistes peptidiques des PARs utilisés, seul le peptide activateur de PAR1 a conduit à une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains, tandis que le peptide agoniste de PAR4 l'a réduite. Comme le peptide activateur de PAR1, la thrombine, une protéase capable d'activer à la fois PAR1 et PAR4 a induit une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains. La mobilisation calcique induite par la thrombine a été inhibée par un antagoniste de PAR1 et potentialisée par un antagoniste de PAR4. La thrombine exerce donc un double effet contradictoire sur les neurones sensitifs humains, induisant un signal calcique par l'activation de PAR1 et l'inhibant par l'activation de PAR4. Les surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII mais pas ceux de contrôles sains, ont provoqué un flux calcique dans les neurones sensitifs humains par un mécanisme dépendant de l'activation de PAR1. Nos résultats mettent en évidence l'importance de réduire la sensibilisation des neurones sensitifs humains dépendante de l'activation de PAR1 dans le SII. Notre technique de culture de GSD humains offre de nouvelles applications en neurosciences et nos résultats permettent d'envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques quant à l'utilisation d'un antagoniste de PAR1 pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII. / Irritable Bowel Syndrome (IBS) is characterized by chronic abdominal pain, diarrhea and/or constipation. Sensory neurons from IBS patients are considered to be over-activated, being thereby responsible of the experienced visceral pain. Among mediators involved in IBS, proteases seem to have a prominent role. First, proteolytic activity is increased in the supernatants of colonic biopsies from IBS patients. Second, these proteases activate " Proteases-Activated Receptors " (PARs) in rodent sensory neurons. Rodent primary afferent activation can be induced by a PAR2-dependent mechanism, which generates visceral hypersensitivity. This mechanism can be inhibited by a PAR4-dependent mechanism. In some cell types such as platelets, PARs may have very different functions in rodent versus human. The expression and the signalization of PARs in human sensory neurons have never been explored. The general aim of this thesis was to study the signalization of PARs and to identify the effect of mediators present in tissues from IBS patients, on their ability to activate human sensory neurons. The final objective was to identify new possible therapeutic targets to treat visceral pain associated with IBS. The first objective was to establish a protocol for culturing human sensory neurons isolated from thoracic dorsal root ganglia (DRG). Thoracic DRG contain the stroma of sensory neurons projecting from the colon. The culture of human sensory neurons was 90% pure with viable and functional neurons, which were able to induce calcium flux in response to different pro-nociceptive agonists. PAR expression was studied in cultures and compared to fresh DRG tissues. PAR1, PAR2 and PAR4 as well as others receptors from the " Transcient Receptors Potential " (TRPs) channel family were similarly expressed in neurons from fresh DRG tissues and in cultured sensory neurons, thereby validating the physiological phenotype of human DRG neurons in culture. The effect of PAR agonists was studied by imaging calcium mobilization in human sensory neuron cultures. From all PAR agonist peptides used, only PAR1 agonist peptide was able to increase calcium signaling in human sensory neurons, while PAR4 agonist peptide was able to decrease this calcium signaling. Similar to PAR1 agonist peptide, thrombin a protease capable of activating both PAR1 and PAR4, induced an increase of calcium flux in human sensory neurons. Thrombin-induced calcium mobilization was inhibited by a PAR1 antagonist and was potentiated by a PAR4 antagonist. Thus, thrombin has a contradictory double effect on human sensory neurons, inducing calcium signaling through PAR1 activation and inhibiting calcium signaling through PAR4 activation. In addition, supernatants of colonic biopsies from IBS patients but not from healthy controls, provoked an increased calcium signaling in human sensory neurons. This effect was dependent on the activation of PAR1. In the context of IBS, our results highlight the importance of targeting PAR1-induced sensitization in human sensory neurons. The DRG culture technique we have established offers important and new applications in the domain of neurosciences. All together, these data point to new therapeutic possibilities for the use of PAR1 antagonist in the treatment of visceral pain associated with IBS.

Les douleurs abdominales, principale cause de consultation en gastroentérologie, sont souvent le reflet d’un dysfonctionnement du tractus gastro‐intestinal, parfois responsable d’un Syndrome de l’Intestin Irritable (SII) ou d’une Maladie Inflammatoire Chronique de l’Intestin (MICI). Ces deux types de pathologies ont des caractéristiques bien distinctes (inflammation sévère avec des phases de poussée et de rémission dans le cas des MICI, absentes dans le SII). Cependant elles ont aussi des caractéristiques communes comme le développement d’une hypersensibilité colique (HSC), visible pendant les phases de rémission des MICI. Cette hypersensibilité, dont la physiopathologie est encore mal connue, entraîne une altération de la qualité de vie des patients. Il paraît donc nécessaire de comprendre les mécanismes qui sous‐tendent son apparition, son développement et son maintien, afin de développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Les canaux ioniques sont des cibles intéressantes pour cela. Deux ont particulièrement retenu notre attention : le canal ASIC3 (Acid Sensing Ion Channels), sensible à l’acidose tissulaire et impliqué dans de nombreux processus physiopathologiques douloureux et le canal calcique Cav3.2 (voltage‐gated calcium channel) impliqué dans la mécanoperception physiologique et physiopathologique. Dans une première partie, nous avons évalué le rôle des sous‐unités ASIC3 dans l’hypersensibilité colique. Pour cela, nous avons utilisé plusieurs modèles animaux mimant une hypersensibilité colique de diverses origines chez des animaux déficients pour le canal ASIC3 et leurs littermates. Le premier modèle utilisait du DSS à deux concentrations : 0.5% et 1% induisant une hypersensibilité colique respectivement sans et avec inflammation. Le deuxième modèle mimait une hypersensibilité colique induite par une infection gastro‐intestinale. Pour cela, nous avons utilisé une bactérie AIEC (Adherent Invasive Escerichia Coli) de souche LF82 anormalement présente chez les patients atteints de la maladie de Crohn. Nous avons mis en évidence que le canal ASIC3 est impliqué dans la mise en place de l’Hypersensibilité Viscérale d’origine Colique (HSVC) dans ces deux modèles, et que la délétion de cette sous‐unité entraîne une moindre inflammation colique. Dans un dernier modèle, pour déterminer si ces résultats au niveau colique étaient transposables au cas d’une hypersensibilté viscérale d’origine différente, nous avons choisi un modèle de cystite pour lequel nous n’avons pas pu mettre en évidence une implication de la sous‐unité ASIC3. Dans une deuxième partie, nous avons travaillé sur le canal calcique Cav3.2, déjà étudié au laboratoire, et qui n’avait pas montré d’implication dans les douleurs viscérales inflammatoires. Son implication dans l’HSC non inflammatoire a été étudiée à travers deux modèles : le modèle de DSS 0.5% et le modèle de séparation maternelle. Une absence d’hypersensibilité chez les animaux déficients pour ce canal a été mise en évidence, et nous avons trouvé une implication de ce canal calcique chez des patients atteints du SII. La dernière partie de ce travail s’est intéressée à une nouvelle cible pouvant être impliquée dans la perception des stimuli mécaniques au niveau colique, le facteur de transcription EGR‐4. Ce facteur de transcription appartient à la famille des protéines en doigts de zinc et est extrêmement conservé entre les êtres vivants ; il est impliqué dans de nombreuses cascades de signalisations cellulaires. Une équipe clermontoise a montré son implication dans la mécanoperception chez la plante. Nous avons donc voulu savoir si cette implication était transposable à la souris et nos travaux se sont alors concentrés sur le côlon et sur l’implication de ce facteur lors d’une stimulation mécanique. Il est principalement exprimé au niveau des cellules musculaires lisses et est surexprimé au niveau du côlon dans le cas d’une stimulation mécanique. / Abdominal pain is one of the most common gastrointestinal disorder which accounts for the majority ofconsultations in general practice and half of those in gastroenterology. They often reflect a dysfunction ofthe gastrointestinal tract may be responsible for irritable bowel syndrome (IBS) or chronic inflammatorybowel disease (IBD). Despite significant differences particularly illustrated by a severe inflammatoryphenomenon associated with IBD which is not observed in IBS, these pathologies share colonichypersensitivity (CHS) as a common feature. This hypersensitivity whose pathophysiology is still poorlyunderstood, results in impaired quality of life of patients. It therefore seems necessary to be able tounderstand the mechanisms that underlie the emergence, development and maintenance of the HSC todevelop appropriate therapeutic strategies. Ion channels are attractive targets because of their critical role insynaptic transmission of sensory information. Two of them in particular caught our attention: ASIC3 channel(Acid Sensing Ion Channels), sensitive to tissue acidosis and involved in many pathophysiological processesand painful calcium channel Cav3.2 (voltage‐gated calcium channel) involved in the physiologic andpathophysiologic mechanoperception.In the first part, we evaluated the role of ASIC3 subnits in colonic hypersensitivity. For this, we used severalanimal models mimicking colonic hypersensitivity of different origins in deficient animals for ASIC3 and theirlittermates. The first model using the DSS at two concentrations: 0.5% and 1% respectively inducing colonichypersensitivity with and without inflammation. The second model mimicking colonic hypersensitivityinduced gastrointestinal infection. For this, we used a AIEC bacteria (Adherent‐Invasive Escerichia Coli) ofLF82 strain abnormally present in patients with Crohn's disease. We were able to show that the ASIC3channel is involved in the establishment of the original Visceral Hypersensitivity Colic (HSVC) found in thesetwo models. We were also able to show that the deletion of this channel leads to lower colonic inflammationin our animals. Then, we evaluated its involvement in a cystitis model and found that this channel was notinvolved in this type of pain or in the resulting inflammation.In the second part, we worked on the calcium channel Cav3.2. This channel already studied in the laboratoryhad shown no involvement in visceral inflammatory pain, we observed his involvement in thenoninflammatory colonic hypersensitivity through two models: the DSS model 0.5% and the maternalseparation model. We were able to demonstrate a lack of hypersensitivity in animals deficient for thischannel. In addition, we found an involvement of this calcium channel in patients IBS, resulting in increasedexpression in these patients compared to control patients.The aim of this third part is to determine the EGR‐4 localization and its involvement in the mouse colonsensitivity to a mechanical stimulus. For that purpose, wild‐type and healthy mice were subjected or not to acolorectal distension (mechanical stimulus) for 10 seconds via inflation of a balloon inserted at 1cm from theanal margin. Then, we analyzed the expression of EGR‐4 at different time points after the distension at themRNA level in the colon, dorsal root ganglia (DRG) and spinal cord by quantitative RT‐PCR and its cellularlocalization in DRG, and in colon after whole‐mount dissection, by immunohistochemistry. We also identified targeted genes of this transcription factor in mouse colonic epithelial cells transfected by an EGR‐4expressing vector after microarray analysis. EGR‐4 transcription factor is localized in the colon, DRG andspinal cord cells. In addition, its expression is modified after colorectal distension in a time dependentmanner.

Les douleurs viscérales chroniques font partie des effets secondaires des patients traités pour des cancers de la zone pelvienne. Ces douleurs peuvent affecter grandement la qualité de vie de ces patients. Dans les cas les plus graves, il n'existe pas de traitement analgésique efficace. Ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces constitue un enjeu majeur. Au sein de notre laboratoire, le potentiel réparateur et immuno-modulateur des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) a déjà été démontré dans un modèle d'ulcération colorectale radio-induite chez le rat. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'évaluer d'abord la pertinence de l'utilisation de ce modèle pour l'étude de l'hypersensibilité viscérale persistante radio-induite, puis, le bénéfice thérapeutique de l'utilisation des CSM comme agent antinociceptif. Nous avons dans un premier temps démontré, dans ce modèle, le maintien au cours du temps d'une hypersensibilité viscérale associée à une sensibilisation centrale persistante après irradiation, validant ainsi le modèle. Nous avons ensuite montré l'implication des mastocytes (MC) et suggéré l'implication du neuromédiateur NO dans les mécanismes de la sensibilisation périphérique sous-tendant une telle hypersensibilité. Nous avons enfin mis en évidence que le traitement par des CSM permettait la réduction de l'hypersensibilité viscérale radio-induite persistante. La capacité des CSM à moduler l'activation des MC et/ou leurs interactions avec les fibres nerveuses pourrait être impliquée dans leur action antinociceptive. En conclusion, ce travail a permis d'élargir le spectre d'action thérapeutique des CSM dans notre modèle d'étude.

Ce travail porte sur la mise au point des nanocochléates intégrant à la fois l’amphotéricine B (AmB) et la miltéfosine (hexadécylphosphocholine, HePC) dotés de propriétés adéquates pour une administration par voie orale pour le traitement de la leishmaniose viscérale. Notre premier axe de recherche a été l’étude des interactions de l’AmB et de l’HePC avec les monocouches de lipides de DOPS (dioleoyl phosphatidylsérine) et de Cho (cholestérol) dans le développement de nanocochléates chargés avec ces deux principes actifs. Les résultats expérimentaux nous ont permis de déterminer le rapport drogue/lipides optimal pour la formulation des nanocochléates : 9DOPS/1Cho/0,5AmB/0,5HePC et de confirmer que dans la formulation de nanocochléates, l’AmB et l’HePC sont incorporés de façon stable et se situent au sein des bicouches lipidiques entre des lipides, plutôt que dans la phase aqueuse entre les bicouches.Notre second axe de recherche a porté sur la formulation et la caractérisation des nanocochléates chargés en AmB et en HePC. Ces nanocochléates ont été formulés à partir des liposomes unilamellaires encapsulant ces deux principes actifs. Les paramètres expérimentaux majeurs (taille de liposomes, proportion DOPS/1Cho) ont été optimisés. Les propriétés physico-chimiques des nanocochléates, telles que la taille, la charge de surface, la morphologie, le rendement d'encapsulation, l’organisation des principes actifs et la stabilité pendant le stockage au cours de temps ont été étudiées. En vue d'une formulation orale, la libération des principes actifs in vitro ainsi que la stabilité des nanocochléates in vitro dans les milieux gastro-intestinaux ont également été étudiés d’après la Pharmacopée des Etats-Unis. Enfin, une étude in vivo préliminaire chez le rat portant sur la pharmacocinétique plasmatique d'AmB après administration orale de nanocochléates chargés en AmB avec ou sans HePC en comparaison avec l’Ambisome® et la Fungizone® a été entamée. Les résultats préliminaires ont démontré une absorption significative par voie orale de l’AmB.Ce travail a permis de développer des nanocochléates avec des propriétés appropriées pour une formulation contenant à la fois l’AmB et l’HePC administrable par voie orale. Néanmoins, des optimisations restent à réaliser avant d’envisager une application clinique. / The aim of this work was to formulate nanocochleates containing both Amphotericin B (AmB) and miltefosine (hexadecylphosphocholine, HePC) with properties suitable for administration by the oral route for the treatment of visceral leishmaniasis. The first part of this work was a fundamental study of the interactions between AmB and HePC and monolayers of dioleylphosphatidylserine (DOPS) with or without cholesterol (Cho), to provide a basis for the formulation of nanocochleates containing the two active molecules. The results allowed us to define the optimal proportions for the formulation of nanocochleates: 9DOPS/1Cho/0.5AmB/0.5HePC and to predict that AmB and HePC would be incorporated stably into the formulation and would be located between the lipids in the bilayers rather than in the aqueous phase between the bilayers. The second part of the work was the formulation and characterization of nanococheates containing both AmB and HePC. These were derived from unilamellar liposomes containing the two active molecules. The crucial experimental parameters (size of the liposomes, ratio of DOPS to Cho) were optimized. The physico-chemical properties of the nanocochleates, such as the size, surface charge, morphology, encapsulation yield, the organization of the active molecules and the stability during long-term storage were studied. Since the formulation was destined for the oral route, in-vitro drug release and the stability of the nanocochleates in simulated gastro-intestinal media were studied according to the recommendations of the US Pharmacopeia. Finally, a preliminary in-vivo study of the plasma pharmacokinetics of AmB after oral gavage to rats of nanocochleates contained AmB with or without HePC, in comparison with AmBisome and Fungizone, was carried out. A significant oral absorption of AmB was observed. This work has led to the formulation of nanocochleates containing AmB and HePC with appropriate properties for oral administration. However, further optimization is necessary before such particles will be suitable for clinical use.

Les douleurs abdominales chroniques, souvent associées à une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC), sont l’un des symptômes majeurs constatés lors du syndrome de l’intestin irritable (SII). Le SII est une colopathie chronique fonctionnelle touchant environ 11% de la population mondiale et altérant significativement la qualité de vie des patients. L’étiologie multifactorielle de cette pathologie rend la physiopathologie complexe. Les gastroentérites infectieuses ont été décrites comme l’un des facteurs de risque dans le développement du SII-post-infectieux (SII-PI). Le SII-PI survient en effet dans 4 à 31% des cas suite à une gastroentérite aigüe d’origine bactérienne, virale ou parasitaire. Ces infections peuvent avoir de nombreuses répercussions et en particulier sur l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale, le système immunitaire ou encore sur le microbiote intestinal. Par ailleurs, suite à une infection parasitaire, le risque de développer un SII est de 40% contre seulement 14% suite à une infection bactérienne.Blastocystis est le parasite intestinal le plus fréquemment retrouvé chez l’Homme. Néanmoins, malgré de récentes études épidémiologiques rapportant une plus forte prévalence de ce parasite chez les patients atteints de SII, son rôle en santé humaine reste débattu. De plus, d’autres études rapportent que les individus porteurs de ce parasite présentent des douleurs abdominales et sont atteints d’une dysbiose intestinale. Actuellement, l’absence d’un modèle animal d’infection par Blastocystis reproductible ne permet pas d’étudier les mécanismes physiopathologiques liés à l’infection et donc d’explorer la contribution éventuelle de ce parasite dans le SII.Les objectifs de ce travail de thèse étaient tout d’abord de mettre en place un modèle murin d’infection expérimentale par Blastocystis pour dans un deuxième temps évaluer si ce parasite est capable d’induire une HSVC et une dysbiose intestinale avec l’objectif d’établir un nouveau modèle de SII d’origine infectieuse chez le rat. Pour répondre au premier objectif, le pouvoir infectieux de différents sous-types et différentes formes du parasite (formes vacuolaires ou kystes), isolés de cultures axéniques ou purifiés à partir de selles de patients et d’animaux a été évalué chez des animaux de laboratoire (rats et souris). Nous avons ainsi réussi à établir un modèle reproductible d’infection chronique par Blastocystis chez le rat de laboratoire à l’aide de kystes purifiés à partir de selles humaines.L’utilisation de ce modèle in vivo, nous a permis de mettre en évidence que le sous-type 4 (ST4) de Blastocystis induit une HSVC sans origine inflammatoire chez les rats expérimentalement infectés. De plus, les animaux développent un comportement type anxio-dépressif corrélé à l’HSVC. La dysbiose intestinale associée à l’infection se caractérise par une augmentation de la richesse bactérienne et une diminution du ratio Firmicutes/Bacteroidetes. Par ailleurs, nous avons corrélé l’HSVC à l’augmentation de l’abondance relative du genre Bacteroides et la diminution de l’abondance relative de la famille des Clostridiaceae, bactéries productrices d’acides gras à chaine courte (AGCC). Une diminution des taux d’AGCC fécaux a d’ailleurs été constatée chez les rats infectés. De plus, nous avons mis en évidence une augmentation de l’activité de protéases à sérine dans les fèces des animaux infectés pouvant expliquer l’HSVC.Ces données suggèrent qu’une infection gastro-intestinale par Blastocystis serait associée à une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC) et à un déséquilibre de la flore intestinale (dysbiose). Ainsi, ce nouveau modèle d’infection pourrait être un bon modèle de SII d’origine infectieuse et pourrait donc contribuer à un meilleur diagnostic et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des pathologies chroniques de l’intestin chez certains individus. / Chronic abdominal pain often associated with colonic hypersensitivity (CHS) is one of the major symptoms of irritable bowel syndrome (IBS). IBS is a functional chronic disorder affecting ~11% of worldwide population and disturbing patients’ quality of life. Etiology is multifactorial and thus pathophysiology is complex and remains poorly understood. Infectious gastroenteritis has been described as one of the risk factors for development of post-infectious IBS (PI-IBS). PI-IBS can occur in 4-31% of patients following acute gastroenteritis of bacterial, viral or parasitic origin. Numerous studies support a role for pathogen-mediated modifications in the resident intestinal microbiota, epithelial barrier integrity and immune activation in PI-IBS. Interestingly, the risk of IBS is highest with protozoal enteritis, with ~40% of individuals developing IBS against ~14% following bacterial infection. Blastocystis is the most common intestinal parasite found in human intestinal tract. Nevertheless, clinical relevance remains controversial, despite recent epidemiological studies showing a higher prevalence of this parasite in IBS patients. Interestingly, studies report that individuals carrying Blastocystis display abdominal pain and intestinal dysbiosis. Currently, the lack of reproducible animal model of Blastocystis infection does not allow to study the pathological mechanisms related to infection and thus to explore the potential contribution of this parasite in IBS.The aims of this study were first to develop a murine model of Blastocystis infection and then to investigate whether this parasite could lead to the development of intestinal dysbiosis associated CHS with the aim of developing a new PI-IBS rat model.The first aim was to evaluate the infectivity of different parasitic subtypes and stages (vacuolar and cystic forms) isolated from axenic cultures or purified from human or animal feces, into laboratory animals (rats and mice). Interestingly, we succeeded in the development of a reproducible model of chronic infection by Blastocystis in laboratory rats using cysts purified from human stool.Using this animal model, we found that Blastocystis ST4 induced non inflammatory CHS in infected rats. In addition infected rats developed anxiety- and depressive-like behavior correlated with CHS. Infection associated intestinal dysbiosis was characterized by increased bacterial richness and decreased Firmicutes/Bacteroidetes ratio. Interestingly, we correlated CHS with the increase in the relative abundance of genus Bacteroides and the decrease in the relative abundance of the family Clostridiaceae, some bacteria producing Short Chain Fatty Acids (SCFAs). Indeed, fecal SCFAs levels were decreased in infected rats. These decreases were correlated with the relative abundance of genus Oscillospira which was also described increased in Blastocystis individual carriers. In addition, we have demonstrated an increase in fecal serine protease activity in infected animals that may explain development of CHS.These data suggest that a gastrointestinal infection with Blastocystis may be associated with the establishment of intestinal dysbiosis associated CHS. Thus, this new infectious model could be a good model of PI-IBS and could therefore contribute to a better diagnosis and development of new therapeutic strategies for chronic bowel diseases.

Les kinétoplastidés sont des protozoaires flagellés responsables de maladies tropicales négligées mortelles telles que la leishmaniose viscérale (L. donovani et L. infantum) ou la trypanosomiase humaine africaine (T. brucei), pour lesquelles les traitements disponibles sont très limités. Depuis quelques années, on observe un regain d'intérêt pour le développement de nitrohétérocycles aromatiques anti-infectieux tels que le delamanide et le féxinidazole. De récentes études indiquent que l'activité anti-kinétoplastidés de ces dérivés repose sur leur bioactivation sélective par des nitroréductases parasitaires, conduisant à la formation de métabolites réduits électrophiles, fortement cytotoxiques. Suite à des études préliminaires réalisées dans notre équipe en série 8-nitroquinoléin-2(1H)-one, ces travaux de thèse portent sur la synthèse et l'étude in vitro de l'activité antiparasitaire de 80 dérivés notamment fonctionnalisés en positions 3 et 6 du pharmacophore par divers motifs, notamment via la mise au point de réactions d'halogénation sélective et de couplages pallado-catalysés. Ainsi, 5 nouvelles molécules hits (4 anti-kinétoplastidés et 1 sélective de T. brucei) ont été identifiées (0,01 µM ≤ CI50 ≤ 7 µM et 13 < IS < 1500), trois d'entre-elles étant des substrats sélectifs des nitroréductases parasitaires de type I. Afin de préciser les relations structure-activité, une étude des potentiels de réduction a également été menée. Des études physico-chimiques (solubilité, test de perméabilité PAMPA) et pharmacocinétiques in vitro (stabilité microsomale et fixation à l'albumine humaine) sont venues compléter ce travail. Enfin, des évaluations de la mutagénicité et de la génotoxicité de ces hits sur des cellules procaryotes et humaines ont été conduites, dans le but de statuer sur leur potentiel pharmaceutique antiparasitaire humain et vétérinaire. / Kinetoplastids are flagellated protozoan parasites responsible for lethal neglected tropical diseases, such as visceral leishmaniasis (L. donovani and L. infantum) or sleeping sickness (T. brucei brucei), for which very few drugs are available. Nowadays, nitroheterocyclic compounds present a renewed interest as anti-infective agents, as illustrated by the development of fexinidazole and delamanid. Some recent studies demonstrated that the antikinetoplastid activity of these derivatives involves their selective bioactivation by parasitic nitroreductases, leading to the formation of electrophilic reduced metabolites, highly cytotoxic. Based on preliminary studies conducted in our team in 8-nitroquinolin-2(1H)-one series, this PhD work is about the synthesis and in vitro antiparasitic study of 80 derivatives mainly functionalized at positions 3 and 6 of the pharmacophore by various substituents, especially via the optimization of selective halogenation and pallado-catalyzed cross coupling reactions. Thereby, 5 new hit compounds (4 antikinetoplastid and 1 selective of T. brucei) were identified (0.01 µM ≤ IC50 ≤ 7 µM and 13 < SI < 1500), three of them being selective substrates of type I parasitic nitroreductases. In order to refine the structure-activity relationship studies, an analysis of reduction potentials was also conducted. In vitro physicochemical (solubility, PAMPA permeability assay) and pharmacokinetic (microsomal stability and human albumin binding) experiments completed this work. Finally, the mutagenicity and genotoxicity evaluations of these new hit compounds toward prokaryotic and human cells were realized, in order to assess their human and veterinary antiparasitic pharmaceutical potential.

La maladie de Crohn est caractérisée par l'alternance de phases de rémission et de poussées d'inflammation intestinale, de survenue imprévisible. L'objectif de la thèse était d'étudier l'effet, en terme d'activité cérébrale (IRMf), de l'incertitude dans l'anticipation de la survenue d'une douleur viscérale dans la MC en rémission. Les résultats majeurs montrent que dans la MC, cette phase est associée à une hyperactivation significative, par rapport au sujet sain, du cortex cingulaire antérieur et postérieur, de l'insula, du thalamus et de l'amygdale. Il s'agit de régions clés dans la gestion sensorielle, cognitive et émotionnelle de la douleur. En conclusion, la MC est associée à une hyperréactivité cérébrale liée au caractère incertain de la survenue d'une douleur viscérale. Ceci peut expliquer une plus grande vulnérabilité des patients face aux effets du stress sur leurs symptômes et le cours de leur maladie et l'efficacité des thérapies cognitivo-comportementales. / Crohn's disease (CD) is a chronic recurring inflammatory bowel disease, with unpredictable recurrence of flares; this unpredictability leads to great anticipatory anxiety and stress. The aim of this thesis was to study the effect, in terms of brain activity (fMRI), of uncertainty in the anticipation of visceral pain in quiescent CD. Le main results show that in CD, uncertainty is associated with hyperactivity in the anterior and posterior cingulate cortex, insula, thalamus and amygdala. These are key regions in the regulation of sensory, cognitive and emotional aspects of pain. In conclusion, CD comprises excessive cerebral reactivity linked to the uncertain character of the occurrence of visceral pain. This might account for the greater vulnerability of CD patients towards the effects of stress on their symptoms and the course of their disease, as well as the efficacy of behavioral therapies that aim at modifying the activity of limbic structures.

Visceral leishmaniasis (VL) or kala-azar is a parasitic infectious disease that is fatal if left untreated. Two types of Leishmania species are causal agents of VL: Leishmania infantum and Leishmania donovani. VL caused by L.infantum is a zoonosis and is endemic in countries around the Mediterranean basin and in Latin-America. VL caused by L. donovani is assumed to be an anthroponosis and is endemic in East-Africa and the Indian subcontinent.<p><p>VL is considered as a major public health problem in the Indian subcontinent and the annual case load of VL in this focus is represents around 80% of the global burden. In Nepal, a quarter of the country’s population is estimated to be at risk of this disease. The disease in the ISC is caused by L. donovani, which is transmitted from man to man by the bite of the sandfly Phlebotomus argentipes. VL occurs predominantly among the poorest of the poor. Since 2005, the governments of Bangladesh, India and Nepal have been engaged in a collaborative effort to eliminate VL from the region. The strategies to control the disease include early diagnosis and treatment, along with vector control measures, effective disease surveillance, social mobilization and partnership building, and clinical and operational research. In recent years, considerable efforts were made within the elimination initiative. Still, important gaps remain in the understanding of the VL epidemiology, and impact as well as on the best approach to case management or vector control. These knowledge gaps may affect the success of the ongoing VL elimination initiative and make it difficult to meet the set target of bringing the incidence down to less than 1 case per 10,000 by 2015. With this background we focused on some of the knowledge gaps; we wanted to generate evidence and offer sound recommendations for policy makers to underpin the ongoing VL elimination initiative in the Indian subcontinent in general and in Nepal in particular. <p><p>We have - for the first time- described the epidemiology of L. donovani infection in high transmission areas in Nepal. The sero-prevalence of L. donovani infection was 9% in these communities, but there was wide variation between endemic villages (5-15%). The seroprevalence rates remain however substantially lower than those observed in a parallel study in the neighbouring districts in Bihar, India. In our study 39% of individuals who live together in a house with at least one recent VL case were serologically (DAT) positive compared to 9% in the overall study population in the same endemic region. This pattern suggests that untreated VL cases are the main source of transmission and sharing the same household is an important risk factor for L. donovani infection. Therefore, the VL elimination campaign recently initiated an active case detection strategy including the search of active cases of VL and post-kala-azar dermal leishmaniasis (PKDL).<p><p>Generally the risk factors for VL are linked to precarious housing conditions and an environment that provides excellent breeding sites for the sandfly vector.VL has thus been largely considered as a disease of the rural poor. However, with occasional cases being reported also from town e.g. Dharan in south-eastern Nepal, questions were raised about possible extension of transmission to urban areas.<p><p>We conducted an outbreak investigation including a case-control study among the residents of Dharan town. We documented several clusters of VL cases in the more peripheral wards of the town. These are wards with new settlements where the poorest migrants install themselves. They are typically a rural-urban interface with most residents dependent on daily wages as agricultural labourers. However, several factors pointed to urban transmission: firstly, we found a strong association between VL and certain housing factors. Secondly, the clustering of VL cases in space and the intra-household clustering makes urban transmission more likely than infection due to migration. Finally, the entomological data also provide further evidence in support of local transmission of VL inside the town. The vector P. argentipes was captured repeatedly inside the town, and some of them were infested with L. donovani.<p><p>We studied the health seeking behavior and documented the households cost of VL care in a miltefosine-based programme after the intensified implementation of VL control efforts in Nepal. We enrolled 168 patients that had been treated for VL within twelve months prior to the survey in five districts in south-eastern Nepal. We observed a median delay of 25 days to present to the appropriate level of the primary healthcare system. Most patients first visited unqualified local practitioners or traditional faith healers for VL care. With a median total cost of US$ 165 per episode of VL treatment, the economic burden of VL across all households was 11% of annual household income or 57% of median annual per capita income. About half of the households exceeded the catastrophic expenditure threshold of 10% of annual household income. Our findings seem to suggest that, compared to previous studies, the economic burden of VL (as a % of household income) has indeed decreased. However, despite the provision of free diagnostics and drugs by the government, households still incurred substantial medical out-of-pocket expenditure, especially at private providers. The government should consider specific policies to reduce VL care costs such as a conditional cash programme for travel and food, and a better health insurance scheme. <p><p>We monitored clinical outcomes of VL treatment with miltefosine up to 12 months after the completion of therapy and explored the potential role of patient compliance, drug resistance, and reinfection. The initial cure rate was 95.8% and cure rate at 6 months after treatment was 82.5%, which further dropped to 73.3% at 12 months after miltefosine treatment. The relapse rate at 6 months was 10.8% and 20.0% at 12 months i.e. relapse is observed in one-fifth of miltefosine treated VL patients in Nepal. The decreased effectiveness of miltefosine observed in our study is an alarming signal for the ongoing VL elimination initiative and implicates the need for reviewing the drug policy in the Indian subcontinent. Relapse was most common among children (<12 years of age) and continued to occur beyond the commonly used 6-month follow-up period. No significant clinical risk factors or predictors of relapse apart from age <12 years were found. Parasite fingerprints of pre-treatment and relapse bone marrow isolates were similar within 8 tested patients, suggesting that clinical relapses were not due to re-infection with a new strain, but due to true recrudescences. MIL blood levels at the end of treatment were similar for cured and relapsed patients.The MIL-susceptibility of 131 VL isolates was also analysed in vitro with a promastigote assay and the mean promastigote MIL-susceptibility (IC50) of isolates from definite cures was similar to that of relapses.<p><p>We also assessed patient adherence to miltefosine treatment for VL given on an unsupervised ambulatory basis, prescribed under routine conditions (i.e. little or no time for treatment counselling) in government primary healthcare facilities. Our findings showed that adherence is a problem and the target of 90% of capsules taken is not reached in 15% of the enrolled patients. The gastrointestinal related side-effects and treatment-negligence after the resolution of clinical symptoms of VL were the main reasons for poor adherence. Effective counselling during the treatment, a short take-home message on the action and side effects of miltefosine, and on the importance of adherence are the best way to prevent poor adherence.<p><p>Post-kala-azar dermal leishmaniasis is more commonly seen in inadequately treated cases which is considered as a reservoir of infection maintaining disease transmission. The occurrence of PKDL in Nepal is relatively low compared to neighbouring countries involved in the elimination initiative. Supervised and adequate treatment of VL seems essential to reduce the risk of PKDL development. Policy makers should include surveillance and case management of PKDL in the VL elimination programme.<p> / Doctorat en Santé Publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La douleur abdominale post chirurgicale reste une douleur difficile à gérer. Cette douleur présente 2 composantes : (1) une composante pariétale liée à l’agression des muscles de la paroi abdominale et du péritoine pariétal et (2) une composante viscérale liée à l’agression du péritoine viscérale et des viscères. La douleur pariétale est bien systématisée, elle correspond à des métamères bien identifiés. Par contre la douleur viscérale est souvent mal localisée, irradiée ou transférée à un site cutané. Les AL administrés par l’intermédiaire d’un cathéter d’infiltration pariétal, d’un bloc de la paroi abdominale ou par voie systémique montrent une efficacité clinique dans l’analgésie post opératoire d’une chirurgie abdominale. Cependant le mécanisme d’action des AL en fonction de leurs voies d’administration n’est pas bien élucidé. Le but de nos études est d’explorer l’effet des AL sur les deux composantes de la douleur abdominale dans un modèle animal en fonction de leur voie d’administration. Nous avons réalisé 3 études expérimentales :1-Dans l’étude 1 nous avons comparé l’effet de la ropivacaïne administrée par voie systémique ou par un cathéter pré péritonéal sur la douleur pariétale et viscérale dans un modèle de laparotomie chirurgicale chez le rat.. 2-Dans l’étude 2 nous avons validé un bloc de la paroi abdominale chez le rat.. 3-Dans l’étude 3 nous avons comparé l’effet de la bupivacaïne par voie systémique à l’effet obtenu par l’administration de la bupivacaïne par un bloc de la paroi abdominale. Nous avons également comparé l’effet des Al par voie systémique à une vagotomie chimique préventive. L’ensemble de ces travaux montrent que lors d’une laparotomie, les AL sont efficaces dans le traitement de la nociception aussi bien par voie systémique que par voie locorégionale. Nous avons démontré qu’un bloc de la paroi abdominale, ainsi qu’une infiltration pré péritonéale diminuaient la transmission de la nociception viscérale vers le SNC par action directe sur les terminaisons nerveuses pariétales. De plus, lors d’une laparotomie, l’administration systémique d’AL montre une efficacité dans l’inhibition de la transmission de la nociception viscérale vers le SNC associée à un effet anti inflammatoire local et systémique supérieure à celui d’une administration locorégionale. / The abdominal post surgical pain has two components : (1) a parietal component due toaggression of the abdominal wall muscles and the parietal peritoneum and (2) a visceralcomponent due to aggression of the visceral peritoneum and viscera. Parietal pain is welllocalized; it corresponds to identified dermatomes. Otherwhise, visceral pain is often badlylocalized. Local anesthetics injected through a parietal catheter of infiltration, an abdominal wall blockor by a systemic administration show clinical efficiency in post operative analgesia afterabdominal surgery. However, the action mechanisms of local anesthetics according to theiradministration route are not well clarified. The purpose of our studies is to explore localanesthetics effect on both components of the abdominal pain in an animal model according totheir administration route.In this purpose we realized three experimental studies :1- In the first study, we compared the effect of systemic administration or through a preperitoneal catheter of ropivacaïne on parietal and visceral pain in a model of surgicallaparotomy in the rat. 2- In the second study, we established a block of the abdominal wall in the rat. 3- In the third study, parietal and peritoneal inflammation were induced by carrageenaninjection in the abdominal wall or in the peritoneal cavity in the rat according to theexperimental group. Then, we compared the effect of a systemic administration of bupivacaïneto its administration by an abdominal wall block. Furthermore, the systemic effect of localanesthetics was compared to a preventive chemical vagotomy. These works showed that during laparotomy, local anesthetics are effective in thetreatment of the nociception as well as by systemic or locoregional administration. We showedthat an abdominal wall block as well as a pre peritoneal administration decreased thetransmission of the visceral nociception towards the central nervous system by direct action onthe parietal nerve endings. Furthermore, during a laparotomy, systemic administration of localanesthetics inhibited the transmission of visceral nociception towards the central nervoussystem associated with a local and systemic anti inflammatory effects. This anti inflammatoryeffect was higher than that what we showed by locoregional administration of bupivacaïne.