Universiẗat, Diss., 2003--Köln.

University, Diss., 2006--Würzburg.

Die Familie der RAF-Kinasen umfasst drei Mitglieder, A-RAF, B-RAF und C-RAF. Nur für die B-RAF-Isoform wurde eine wichtige Funktion für die Entwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) gefunden. Das Fehlen von B-RAF führt bei neu generierten embryonalen Neuronen zum Zelltod, weil sie in vitro nicht auf überlebensfaktoren reagieren können. Bei einer zweiten Zelllinie, die durch die Abwesenheit von B-RAF beeinträchtigt ist, handelt es sich um endotheliale Zellen. Ihr Zelltod führt zu inneren Blutungen und zu Letalität von B-RAF-/--Mäusen zwischen Tag 10.5 (E10.5) und 12.5 (E12.5) der Embryonalentwicklung. Dies verhinderte bisher weitere Untersuchungen der neuralen B-RAF-Funktion bei späteren Stadien. Im Gegensatz zu B-RAF-/--Mäusen überleben B-RAFKIN/KIN-Mäuse die Mitte der Embryonalentwicklung, da ihre Endothelzellen vor Apoptose geschätzt sind. Diese Tiere besitzen kein B-RAF, stattdessen wird im B-RAF-Locus ein chimäres Protein exprimiert, das den N-Terminus von B-RAF sowie alle Domänen von A-RAF umfasst. Der Schutz vor abnormaler neuraler Apoptose im Vorderhirn macht diese Tiere zu einem potentiellen Modell zur Untersuchung der Proliferations- und Differenzierungsfunktion von B-RAF, die die Kinase neben der Überlebensfunktion in der ZNS-Entwicklung ausübt. Die detaillierte Untersuchung der B-RAFKIN/KIN-Tiere konzentrierte sich auf die Entwicklung der Hirnrinde. Augenscheinlich waren kortikale Defekte im B-RAFKIN/KIN Vorderhirn: Der Verlust von B-RAF führte zu einer starken Reduzierung von Brn-2 exprimierenden pyramidalen Projektions-Neuronen begleitet von einer Störung der Dendritenbildung mit weniger und dünneren Dendriten in diesen oberen Schichten. Weitere Untersuchungen mit BrdU-Markierungsexperimenten zeigten in der ventrikulären Schicht reduzierte Zellproliferation für E14.5-E16.5 der Mutantenembryonen und ein Migrationsdefizit der spätgebideten kortikalen Neuronen. Während der Proliferationsdefekt der Hirnrinden-Vorläuferzellen mit einer reduzierten ERK-Aktivierung einherging, bleibt der Mechanismus der gestörten neuralen Migration zu erklären. Unsere Hypothese ist, dass die subzelluläre Lokalisation von Phospho-ERK in den wandernden Hirnrinden-Neuronen der B-RAFKIN/KIN-Mäuse verändert sein könnte. Zur Bestäigung der in vivo-Funktion von B-RAF und weiteren Studien zu ihrer unbekannten Rolle in der embryonalen Neurogenese sowie anderen Morphogenesen wäre die konditionale B-RAF Inaktivierung erforderlich. Durch die Deletion des genetischen Materials bzw. die Inaktivierung der Genfunktion in ausgew�hlten Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt ließen sich die Embryo-Letalität sowie unerwünschte pleiotrope Nebeneffekte vermeiden und akkumulierende, kompensierende Entwicklungsveränderungen von Beginn an ausschließen. Um die Cre Rekombinase-Methode einsetzen zu können, wurden floxed B-RAF embryonale Stammzell (ES)-Zelllinien generiert. Außerdem wurde ein auf dem Tetrazyklin Operator basierendes Schaltallel in den B-RAF Genort von embryonalen Stammzellen integriert, so dass die B-RAF Expression konditional und reversibel durch die Zugabe von Doxyzyklin angeschaltet werden konnte. Bisher wurden hochgradige chimäre Mäuse nach Blastozysten-Injektion geboren. Die Keimbahnübertragung dieser chimären Mäuse wird momentan untersucht. Wenn beide konditionale Mauslinien bereit sind, k�nnte die Entwicklung ihres Zentralnervensystems untersucht werden, um die Rolle von B-RAF in der Entwicklung des Nervensystems herauszufinden. / The RAF family of protein kinases consists of three members, A-RAF, B-RAF and C-RAF. Unlike the other isotypes, B-RAF has been found to have an important function for normal development of the central nervous system (CNS), because newly generated embryonic neurons lacking B-RAF cannot respond to survival factors and undergo cell death in vitro. A second cell lineage affected by the absence of B-RAF are endothelial cells and their death leads to internal bleedings and lethality of B-RAF-/- mice between embryonic day 10.5 (E10.5) and E12.5 precluding an opportunity to further analyze neural B-RAF function at a later stage. In contrast to B-RAF-/- mice, B-RAFKIN/KIN mice, which are B-RAF deficient but express a chimeric protein consisting of the unique N terminus of B-RAF and all the domains of A-RAF in the B-RAF gene locus, survive after midgestation because their endothelial cells are protected from apoptosis. More importantly, overall prevention of abnormal neural apoptosis in the forebrain allows us to study proliferation- or differentiation-oriented function of B-RAF other than its survival effects in CNS development. The detailed investigation of B-RAFKIN/KIN animals was concentrated on cortical development. There were apparent cortical defects in B-RAFKIN/KIN forebrain: Loss of B-RAF led to severe reduction of Brn-2 expressing pyramidal projection neurons accompanied by a disruption of dendrite formation in the upper layers. In further analysis, BrdU labelling experiments showed that from E14.5 to E16.5 cell proliferation in the ventricular zone of the mutant mice was reduced and that the late-born cortical neurons failed to migrate properly. While the proliferation defect of cortical progenitors was associated with reduced ERK activation, the mechanism causing impaired neuronal migration remains to be determined. Our hypothesis is that the subcellular localization of phospho-ERK may be altered in migrating cortical neurons in B-RAFKIN/KIN mice. To confirm in vivo function of B-RAF and further study unknown roles in embryonic neurogenesis as well as other morphogenesis, conditional B-RAF knockouts would be the ideal models, which can efficiently avoid embryonic lethality, prevent unwanted pleiotropic side effects and exclude accumulative compensatory developmental changes from the earliest developmental stage on, through the deletion of genetic material/gene function in selected cells at a specific time. The use of site-specific recombinases such as Cre and the successful development of the reversible tetracycline-based switch have provided powerful venues for creating conditional loss-of-function mouse models. Generation of tetracycline-regulated B-RAF and floxed B-RAF mouse embryonic stem (ES) cell lines was performed. Up to now, high-grade chimeric mice were obtained after blastocyst injection of the modified ES cell clones. The germline transmission from these chimeric mice is currently under investigation. When either of conditional mouse lines is ready, detailed examination in their CNS development would be done to reveal how B-RAF plays a real role for normal development of the nervous system.