Die jährliche Geweihregeneration der Cervidae ist einzigartiges Phänomen unter adulten Säugetieren. Rolf et al. konnten zeigen, dass dieser Prozess unter anderem von STRO-1+ mesenchymalen Stammzellen (MSZ) des Rosenstockperiosts ausgeht, deren Proliferation in der Regenerationsphase aktiviert wird. Ziel dieser Arbeit war es das Proliferationsverhalten dieser STRO-1+- und STRO-1- mesenchymalen Stammzellen/Progenitorzellen (MSZ) näher zu charakterisieren. Außerdem sollte die Expression der Yamanaka-Faktoren (c-Myc, Sox2, Nanog, Klf4, Oct4), welche von großer Bedeutung für die Aufrechterhaltung der stammzelltypischen Eigenschaften sind, untersucht werden. Die Gewebestücke des Rosenstockperiosts wurden parallel in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und Nonhematopoietic-Stem-Cell-Medium (NH-Medium) kultiviert. Bei Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen mit Hilfe des Sortiersystems MACs nach dem Oberflächenmarker STRO-1 sortiert. Die Expression der Yamanaka-Faktoren wurde mit Hilfe von RT-PCR und Gelelektrophorese untersucht. Die Oct4-Expression in STRO-1+ MSZ wurde außerdem immunhistochemisch nachgewiesen. Dafür wurden die STRO-1+MSZ nach der Sortierung 24h, 28h, 72h, 96h und 144h kultiviert und das Oct4-Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff immunhistochemisch angefärbt. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt und die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Da Oct4 im Zytosol sowie in langen Zellfortsätzen, die wie Zell-zu-Zellverbindungen imponierten, detektiert wurde, sollte eine mögliche Übertragung von Oct4 untersucht werden. Dazu erfolgte die Ko-Kultivierung von STRO-1+MSZ mit Oct4-GFP-MEF (embryonalen Mausfibroblasten), in denen die GFP an einen Oct4-Promoter gekoppelt ist, und die Überwachung GFP-Expression. Im NH-Medium konnte eine höhere totale Zellzahl (3,5x) sowie eine signifikant höhere tägliche Wachstumsrate und eine höhere totale Anzahl von STRO-1+ MSZ generiert werden. Sowohl STRO-1+- also auch STRO-1 -MSC exprimieren die o.g. Transkriptionsfaktoren medien- und zeitabhängig. Die Fluoreszenzaufnahmen zeigten ein zeitabhängige Oct4-Expression in den STRO-1+ MSZ, insbesondere nach 48h und nach 96h. Zu diesen Zeitpunkten war das Protein nicht nur im Zellkern sondern auch im Zytoplasma und in den Zellfortsätzen bzw. Zell-zu-Zellverbindungen nachweisbar. Im Ko-Kultivierungsversuch stieg die intrazelluläre GFP-Expression sowie die Anzahl der GFP-positiven Zellen im Intervall zischen 24h-48h deutlich an. Die Ergebnisse demonstrieren das hohe Proliferationspotential der STRO-1+ und auch der STRO-1-MSZ, welches über einen langen Zeitraum hinweg aufrechterhalten werden konnte. Die Kultivierung in NH-Medium erwies sich dabei als vorteilhaft. Die Expression der Yamanaka-Faktoren konnte nachgewiesen werden. Die Oct4-positiven STRO-1+ MSZ sind in Lage über einen interzellulären Oct4-Transport die Oct4-GFP-Transkription in den Empfängerzellen zu initiieren. Die Beobachtungen führen zu der Schlussfolgerung, dass es bei der Geweihregeneration ebenfalls zu einer Übertragung von Oct4 von STRO-1+ MSC auf benachbarte Zellen kommen könnte, welches zu einer Dedifferenzierung in der Empfängerzelle führen könnte. Dies würde das schnelle Geweihwachstum erklären. Ob tatsächlich eine endogen induzierte Pluripotenz stattfindet muss jedoch in weiteren Studien untersucht werden.

Chemical modification of the cytosine base via the addition of a methyl group to form 5-­‐methylcytosine (5-­‐mC) is a well-­‐studied example of an epigenetic mark, which contributes to regulation of gene expression, chromatin organisation and other such cellular processes without affecting the underlying DNA sequence. In recent years it was shown that 5-­‐mC is not the only DNA modification found within the vertebrate genome. 5-­‐hydroxymethylcytosine (5-­‐hmC) was first described in 1952 although it wasn’t until 2009 when it was rediscovered in mammalian tissues that it sparked intense interest in the field. Research has found that unlike the 5-­‐mC base from which it is derived, 5-­‐hmC displays variable levels and patterns across a multitude of tissue and cell types. As such the patterns of these DNA modifications can act as an identifier of cell state. This thesis aims to characterize the methyl and hydroxymethyl profiles of induced pluripotent stem cells (iPSCs), derived from control mouse embryonic fibroblast cell line (p53-­‐/-­‐) as well as and methylation hypomorphic (p53-­‐/-­‐, Dnmt1 -­‐/-­‐) mutant cell lines. As such both somatic cells were subject to reprogramming with Yamanaka factors (Oct4, cMyc, Klf4 and Sox2) via the piggyback transposition technique. Successful reprogramming was confirmed by a number of techniques and outcomes, including the de novo expression of a number of key pluripotency related factors (Nanog, Sall4 and Gdf3). Reprogrammed cells were then analysed for transcriptomic changes as well as alterations to their methyl and hydroxymethyl landscapes that accompany reprogramming. Through this work I have shown that the reprogramming of MEF derived cell lines results in a global increase in 5-­‐hmC for both p53-­‐/-­‐ and (p53-­‐/-­‐, Dnmt1 -­‐/-­‐) hypomorphic mutant cell lines – possibly through the reactivation of an alternative form of DNMT1. I demonstrate by both antibody based dot blot assay and genome wide sequencing that the reprogramming of the (p53-­‐/-­‐, Dnmt1 -­‐/-­‐) somatic cells towards a pluripotent state brings about an increase in methylation levels within the cells. This latter observation may indicate that the reprogramming of the cells is driving them towards a more wild type phenotypic state. My studies suggest that lack of DNMT1 function is not a barrier to reprogramming of somatic cells.

Zugl.: Madison, Univ. of Wisconsin, Diss.