Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: During fermentation, nitrogenous compounds serve as nutrients for the yeasts, which enable their growth, functioning and maintenance of the yeasts cells. From a winemaking perspective, a certain amount of nitrogen is required for the yeasts in order to avoid sluggish or stuck fermentation. Moreover, nitrogen metabolism leads to the production of aroma compounds such as higher alcohols, fatty acids and esters which contribute positively to overall sensory characteristics of wine. Nitrogen metabolism (uptake of ammonium and amino acids) have been extensively studied in Saccharomyces cerevisiae. Nonetheless, the fairly great variances observed between strains in terms of preference for certain nitrogen sources and metabolism thereof are not so well understood. Additionally, these mechanisms nitrogen metabolism of non- Saccharomyces yeasts are even vaguer and simply assumed to be globally similar to those of S. cerevisiae. This study aimed to investigate the uptake of nitrogen compounds (ammonium and individual amino acids) by selected non-Saccharomyces yeasts (Lachancea thermotolerans IWBT Y1240, Torulaspora delbrueckii Biodiva TD291, Pichia kluyveri FrootZen, Metschnikowia pulcherrima IWBT Y1123 and Metschnikowia pulcherrima Flavia) to assess the impact of fermentation kinetics and the production of aroma compounds during sequential fermentations with S. cerevisiae under different initial YAN concentrations, with 300 mg/L, 150 mg/L and 75 mg/L, respectively). Fermentations were performed in a synthetic grape juice medium with pure and sequential fermentations. The data showed that the assimilation of nitrogen compounds were species specific. For example, L. thermotolerans preferred alpha amino nitrogen above ammonia, where the opposite hold true for T. delbrueckii. Notable differences could also be identified for the uptake of certain single amino acids. Irrespective of the initial YAN concentrations during sequential fermentations, the yeasts only assimilated about half of the initial YAN. The non-Saccharomyces yeasts did not influence fermentation performance during sequential fermentations. However, a low initial YAN (75 mg/L) had a strong influence on the fermentation kinetics and aroma compound production. The higher uptake (compare to S. cerevisiae) of specific single amino acids by non-Saccharomyces yeasts (especially L. thermotolerans), can be tentatively correlated with certain aroma compounds produced at the end of fermentation. The results also revealed that agitation could impact overall fermentation performance and aroma compound production. This study contributes to an improved understanding of how different initial nitrogen concentrations affect growth, fermentation performances and aroma compound production of wine-related yeasts under fermentative conditions. Moreover, the uptake of single amino acids by selected non-Saccharomyces yeasts had also been identified, which is a good starting point to better understand non- Saccharomyces yeasts nitrogen requirements which may be used for the optimization of nitrogen source addition, during alcoholic fermentation, when used in mixed fermentations in order to ensure a complete alcoholic fermentation. To the best of our knowledge, the uptake of single amino acids and YAN consumption by selected non-Saccharomyces yeasts under fermentation conditions tested, have never been studied before. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Tydens wynfermentasies dien talle stikstof komponente as voedingstowwe vir wyngis wat hul groei, funksie en onderhoud bevorder. Van `n wynmaak perspektief word daar `n sekere hoeveelheid stikstof benodig deur die wyngis om te verhoed dat slepende of onvolledige fermentasies plaasvind. Verder lei stikstofmetabolisme na die produksie van aroma verbindings, soos hoër alkohole, vlugtige vetsure en esters wat positief bydra tot die sensoriese karaktereienskappe van wyn. Die stikstofmetabolisme (opneem ammonium en aminosure) is deeglik nagevors in die wyngis Saccharomyces cerevisiae, maar die klein variasies waargeneem tussen die gisras in terme van die voorkeur van sekere stikstof komponente is egter nog onduidelik. Daarbenewens is die stikstofmetabolisme nog meer onbekend in nie- Saccharomyces wyngis en word dit oor die algemeen aanvaar dat die werking van die stikstofmetabolisme dieselfde is as in S. cerevisiae. Hierdie studie het gestreef om die opneem van stikstof komponente (ammonium en aminosure) te ondersoek van uitverkiesde nie-Saccharomyes gis (Lachancea thermotolerans IWBT Y1240, Torulaspora delbrueckii Biodiva TD291, Pichia kluyveri FrootZen, Metschnikowia pulcherrima IWBT Y1123 and Metschnikowia pulcherrima Flavia) deur te bepaal wat die impak is op die groei-kinetika en op die produksie van aroma komponente gedurende gemengde kultuur fermentasies met S. cerevisae onder verskillende aanvangs assimileerbare stikstof (300 mg/L, 150 mg/L en 75 mg/L). Fermentasies is in sintetiese druiwemos uitgevoer vir beide enkel en gemengde kultuur fermentasies. Die resultate demonstreer dat die assimilasie van stikstof ras spesifiek was. Byvoorbeeld, L. thermotolerans verkies alfa amino stikstof bo ammonium waar die teenoorgestelde waar is vir T. delbrueckii. Beduidende verskille is ook waargeneem vir die opneem van sekere individuele aminosure. Die wyngis het steeds net die helfte van die assimileerbare stikstof opgeneem gedurende gemengde kultuur fermentasies ongeag die aanvangsstikstof konsentrasies. Die nie-Saccharomyces gis het nie die fermentasie kinetika beïnvloed tydens gemengde kultuur fermentasies nie. Daar was egter ook waargeneem dat `n lae assimileerbare stikstof (75 mg/L) `n negatiewe invloed op die fermentasie kinetika sowel as aroma produksie gehad het. Die hoër opname (vergelyking met S. cerevisiae) van sekere aminosure deur nie-Saccharomyces gis, kan tydelik gekoppel word aan die produksie van spesifieke aroma verbindings aan die einde van fermentasies. Die resultate het ook gewys dat die toepassing van skud `n impak het op die fermentasie kinetika sowel as die produksie van aroma komponente. Die studie dra by om beter te verstaan van hoe verskillende aanvangsstikstof die groei, fermentasie kinetika en aroma produksie beïnvloed onder fermentasie kondisies. Die opneem van sekere aminosure deur nie-Saccharomyces gis word ook beskryf, wat `n goeie beginpunt is om beter te vertaan wat die stikstof vereistes vir die geselekteerde wyngis is, wat gebruik kan word vir die optimisering van stikstofaanvullings, sodat die risiko van probleemfermentasies verlaag sal word. So ver as wat ons kennis strek is die opneem van aminosure en die gebruik van assimileerbare stikstof deur nie-Saccharomyces wyngis onder fermentasie kondisies nog nie ondersoek nie.

Abstract The yeast Saccharomyces cerevisiae on solid media forms multicellular colonies. Cells within colonies undergo differentiation and metabolic diversification, including formation of two layers of cells called Upper and Lower cells. The metabolic activity of U and L cells is different. For instance a higher level of autophagy was observed in U cells. This thesis includes a literature review of molecular mechanisms of autophagy in yeasts. Yeast colonies, under starvation conditions, produce volatile ammonia signal. This signal allows them communicate over a distance. Studies, revealing cell differentiation within colonies and ammonia signalling among colonies, were performed in colonies of laboratory strains. Strains isolated from nature, so-called wild strains, form distinct structured colonies, termed fluffy. Yeast within fluffy colonies also form different cell types. However the situation seems to be more complex that within smooth colonies of laboratory strains. Strains were constructed during this study, which express marker proteins Icl2p, Pox1p, Mae1p, Pma1p, Pma2p, Ino1p, Met17p and Atg8p fused with fluorescent labels in order to study cell differentiation and other processes within fluffy colonies. Furthermore, a new system for ...

Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Bc. Nela Drnková Supervisor: Mgr. Marcela Vejsová, Ph.D. Title of diploma thesis: Evaluation of activity of potencial antifungal substances trought the use of microdilution broth method Background: The aim of this thesis was evaluation of antifungal activity of 70 substances trought the use of microdilution broth method. Substances for testing were synthesized at the Faculty of Pharmacy and they were divided into 5 groups based on chemical structure. Methods: The microdilution broth method was used for testing. The antifungal activity of substances was tested on 8 strains of yeasts and filamentous fungi: Candida albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, Trichosporon asahii, Aspergillus fumigatus, Absidia corymbifera a Trichophyton mentagrophytes. Results: The most active substances were in group of salicylanilide N- monosubstituted and N,N-disubstituted carbamates and thiocarbamates. The most effective substances were SAL-1L, SAL-1M, SAL-1N. They were effective on Trichophyton mentagrophytes already at concentration of 1,95 µmol.l-1 . The widest spectrum had substance GP-137, it inhibited the growth of all tested strains, but only at high concentrations. Rhodamine...

O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da inclusão de doses de S. cerevisiae na dieta sobre a digestibilidade da fibra, o consumo de matéria seca, a cinética e o ambiente ruminal de bovinos Nelore alimentados com feno de Tifton-85 (Cynodon spp.), recebendo ou não suplementação energética. Foram utilizados 36 novilhos Nelore canulados no rúmen, com aproximadamente 24 meses de idade e 400 kg de peso corporal (PC) ao início do experimento, em delineamento experimental de blocos casualizados, com seis repetições por tratamento. Os tratamentos foram obtidos em arranjo fatorial 3x2, a partir da combinação de três níveis de inclusão de S. cerevisiae (0, 8 e 40 x109 UFC/animal/dia; CNCM I-1077, Lallemand®) em duas dietas a base de feno de Tifton-85, com ou sem suplementação energética (0 e 0,8% do PC). Foram realizadas coletas de líquido ruminal para mensuração de pH, ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e N-amoniacal, além de esvaziamento total de conteúdo ruminal para determinação do volume, massa total e tamanho do compartimento ruminal. Amostras das fases líquida e sólida da digesta ruminal foram retiradas para as análises dos componentes da digesta e população de microrganismos ruminais através da técnica de PCR em tempo real. A inclusão de levedura aumentou linearmente o consumo de matéria seca (P = 0,03) e de FDN (P = 0,01), no entanto não houve efeito sobre o pH ruminal (P = 0,30). A suplementação energética aumentou a concentração ruminal de AGCC totais (P < 0,01). Em relação à digestibilidade in situ da FDN, a inclusão de levedura promoveu aumento linear para as quatro forrageiras após 24 h de incubação (P = 0,02). A inclusão também aumentou a massa ruminal de MS (P = 0,02) e FDN (P = 0,02), mas não a de FDN indigestível (P = 0,33). Não houve efeito da levedura sobre a população das bactérias celulolíticas mais abundantes no rúmen (F. succinogenes, R. flavefaciens e R. albus) (P = 0,72). Como conclusão, a inclusão de levedura na dieta de bovinos Nelore aumenta a digestibilidade ruminal da fibra, porém o aumento da digestibilidade da fibra não pôde ser explicado por mudanças na população de bactérias celulolíticas no rúmen. / The objective of the study was to evaluate the effect of inclusion of dietary S. cerevisiae on fiber digestion, dry matter intake, kinetics and ruminal environment of Nellore cattle fed with Tifton-85 hay (Cynodon spp.), receiving or not energetic supplementation. Thirty-six rumen cannulated Nellore steers, approximately 24 months old and 400 kg body weight (BW) were used at the beginning of the experiment, in a randomized complete block design with six replicates per treatment. The treatments were obtained in a 3x2 factorial arrangement, by combining three inclusion levels of S. cerevisiae (0, 8 and 40 x109 CFU/animal/day; CNCM I-1077, Lallemand®) in two diets based on Tifton-85 hay, with or without energetic supplementation (0 and 0.8% of BW). Ruminal fluid samples were collected to measure pH, short chain fatty acids (SCFA) and ammonia nitrogen, as well as the rumen evacuation to determine the volume, total mass and size of the rumen compartment. Samples of the solid and liquid phases of the rumen digesta were taken for analysis of the digesta components and population of ruminal microorganisms through the real-time PCR technique. The yeast inclusion linearly increased the dry matter intake (P = 0.03) and NDF (P = 0.01), however with no effects on rumen pH (P = 0.30). Energy supplementation increased the rumen concentration of total SCFA (P < 0.01). The yeast inclusion linearly increased in situ digestibility of NDF of the four forages after 24 h of incubation (P = 0.02). The yeast inclusion also increased the ruminal mass of DM (P = 0.02) and NDF (P = 0.02), but not the indigestible NDF (P = 0.33). There was no yeast effect on a population of the most abundant cellulolytic bacteria in the rumen (F. succinogenes, R. flavefaciens and R. albus) (P = 0.72). In conclusion, the inclusion of yeast in the diet of Nelore cattle increases the rumen digestibility of the fiber, however, it could not be explained by changes in the population of cellulolytic bacteria in the rumen.

Microrganismos geneticamente modificados (OGMs), obtidos através das técnicas de biologia molecular são amplamente utilizados para as mais diversas finalidades, atingindo o ambiente, solo, águas, animais e até mesmo o Homem. Contudo, o comportamento e o destino destes microrganismos no ambiente, depois que sua função tenha sido completada, e onde estes não podem ser controlados, tem sido objeto de preocupação. Para diminuir os riscos potenciais associados à liberação (acidental ou intencional) dos OGMs no ambiente pesquisadores desenvolveram sistemas de contenção de microrganismos geneticamente engenheirados, baseados na clonagem de genes que codificam proteínas tóxicas, sob regulação de promotores indutíveis (para revisão ver Molin et aI., 1993). Estes sistemas permitem o controle da morte celular em tempo pré-determinado, com a indução do promotor que regula o gene que codifica a proteína tóxica. Contudo, embora as leveduras sejam tão importantes e úteis quanto as bactérias, não existem sistemas suicidas usados para contenção destes microrganismos. No presente trabalho, construímos um sistema suicida para a levedura Saccharomyces cerevisiae o qual apresenta o gene da nuclease de Serratia marcescens clonado sob controle do promotor ADH2GAPDH, que é reprimido por glicose. Desde que a nuclease é capaz de destruir DNA e RNA, tal sistema não permitirá que o material genético do OGM em questão, seja transferido para outros microrganismos, após a morte celular. A atividade da nuclease foi detectada in vivo, através da diminuição da viabilidade dos transformantes de levedura, após o consumo da glicose. Quando leveduras mutantes rad52 foram usadas como células hospedeiras, o efeito letal do plasmídeo foi dramaticamente aumentado. Por outro lado, a atividade da nuclease produzida nos tranformantes de levedura foi analisada in vitro, através da incubação de extratos celulares com DNA plasmidiano mostrando a completa degradação deste em gel de agarose. Além disso, em ensaio de microcosmos, a viabilidade das leveduras portadoras do plasmídeo suicida no ambiente diminuiu drasticamente quando comparada com células controles. Estes resultados mostram que a nuclease de Serratía marcescens é expressa de forma ativa em S. cerevísíae sendo capaz de evitar a permanência dos transformantes de leveduras no ambiente, em laboratório, ou em condições simulando o ambiente, sem a necessidade de um indutor adicional. / Genetic Engineered Microorganisms (GEMs), obtained by molecular biology techniques, are becoming of widespread use for different purposes thus reaching the environment, including soil, water, plants, animais and Man. However, the behavior and fate of these microorganisms after their function has been completed in environments where they cannot be physically contained is a matter of concern. To minimize the potential risks associated with the release (deliberate or accidental) of GEMs in the environment, researchers have developed biological containment systems for bacteria which are based on the cloning of genes coding for toxic proteins, under the regulation of regulatable promoters (for review, see Molin et al., 1993). Such suicide systems allow the predetermined control of cell death from the moment the promoter of the killer gene is switched on. However, even if yeasts are as useful and important in biotechnological processes as bacteria, there is no suicide system described so far for the containment of these microorganisms. In the present work, we constructed a suicide system for the yeast Saccharomyces cerevisiae, consisting of the Serratia marcescens nuclease gene, cloned under the control of the yeast AOH2GAPOH promoter, which is repressed by glucose. Since this nuclease is able to destroy DNA and RNA, such suicide system does not allow the genetic material of the GEM to be transferred to other microorganisms upon cell death. The nuclease activity in S. cerevisiae was detected in vivo, through the decrease in cell viability of the yeast transformants, upon glucose consumption. When yeast rad52 mutants were used as the host cells, the lethal effect of the suicide plasmid was dramatically increased. On the other hand, the activity of the nuclease produced in yeast transformants was analyzed in vitro, by incubation of cell-free extracts with plasmid DNA, showing complete degradation on agarose gels. Furthermore, in microcosmos assays, the viability of the yeast cells carrying the suicide plasmid decreased drastically when compared to control cells. These results showed that the S. marcescens nuclease is expressed in an active form in S. cerevisiae, being able to avoid the maintenance of the yeast transformants, either in the laboratory, or in conditions simulating the environment, without the need of adding any inducer.

A espécie Dekkera bruxellensis tem sido detectada como a principal levedura contaminante em diversos processos fermentativos, dentre eles o de produção de etanol combustível, apresentando uma surpreendente capacidade de crescimento e adaptação naqueles substratos. No entanto, pouco se conhece sobre suas características de crescimento em condições de estresse e comportamento fermentativo. Desta forma, este trabalho objetivou avaliar a tolerância ao estresse e as características fermentativas exibidas por três linhagens de D. bruxellensis isoladas da fermentação alcoólica, além do efeito da contaminação em mosto de caldo de cana sobre os parâmetros fermentativos, buscando informações que possam contribuir para o manejo da fermentação alcoólica quando contaminada com esta levedura. Foram realizados testes de caracterização em meio YEPD sólido e líquido em condições estressantes para as três linhagens de D. bruxellensis e uma linhagem de S. cerevisiae (PE-02). O efeito do tratamento ácido associado ao etanol sobre a viabilidade das quatro linhagens em situação de agitação e sem agitação foi também avaliado. Em seguida, testes fermentativos em meio sintético (sem reciclo celular) e em meio de caldo de cana (com reciclo celular e utilizando-se ou não tratamento ácido) foram conduzidos para verificar as características fermentativas das linhagens de D. bruxellensis em comparação com S. cerevisiae, simulando-se uma contaminação por 103 células/mL da linhagem CCA155 em meio de caldo de cana. As três linhagens de D. bruxellensis apresentaram crescimento invasivo em meio YEPD sólido, possivelmente um mecanismo de sobrevivência da levedura em condições estressantes. Observou-se uma variação na resposta das linhagens às situações de estresse (baixo pH e alta concentração de etanol). Em condições não estressantes, a linhagem PE-02 apresentou melhor desenvolvimento, no entanto, em situações de estresse de pH, concentrações de açúcar e etanol, as linhagens de D. bruxellensis desenvolveram-se melhor. O controle eficiente do crescimento destas leveduras poderia ser obtido com um tratamento combinado de baixo pH (1,5) e etanol (9%), porém houve também prejuízo significativo à levedura S. cerevisiae, embora em menor extensão. Em sistema de batelada sem reciclo celular em meio sintético, verificou-se que a agitação influenciou significativamente a produção de etanol e ácidos por D. bruxellensis. O teor alcoólico foi maior quando se utilizou glicose como fonte de carbono ao invés de sacarose. Em sistema de batelada com reciclo celular em meio de caldo de cana, foram obtidos melhores resultados quanto à produção de etanol, menor teor de açúcar redutor total residual e maior eficiência fermentativa quando se utilizou o tratamento ácido do fermento (pH 1,5), assim como melhor controle do crescimento da linhagem CCA155 quando em cultura mista com S. cerevisiae (PE-02). O tratamento ácido utilizado teve efeito não só sobre o crescimento da levedura contaminante, mas também beneficiou a levedura do processo, resultando assim na minimização do efeito da contaminante sobre a fermentação conduzida em meio de caldo de cana sob dez ciclos fermentativos de 12 horas. / The species Dekkera bruxellensis has been considered as the main contaminant yeast in several fermentative processes, including the fuel alcohol production, showing a surprising growth capacity and adaptation in those substrates. However, a little is known about their growth characteristics in stressing conditions and fermentative profile. In this context, this work aimed to evaluate the stress tolerance and fermentative characteristics exhibited by three strains of D. bruxellensis isolated from the alcoholic fermentation, besides the effect of the contamination in sugar cane juice over the fermentative parameters, searching for information that could contribute to the management of the alcoholic fermentation when the medium is contaminated with this yeast. Characterization tests in YEPD medium (solid and liquid) under stressing conditions for the D. bruxellensis and S. cerevisiae (PE-02) strains were carried out. The effect of the acid treatment associated with ethanol over the cell viability of the four strains in shaken and non-shaken flasks was also evaluated. Following, fermentative tests in synthetic medium (without cell recycle) and in sugar cane juice (with cell recycle and with/without acid treatment) were carried out to verify the fermentative characteristics of the strains of D. bruxellensis comparing to S. cerevisiae, simulating a contamination by 103 cells/mL of the strain CCA155 in sugar cane juice. All the strains of D. bruxellensis showed invasiveness in YEPD agar medium, probably a survival mechanism in stressful conditions. A variation in the response of the strains to the stressing conditions (low pH and high ethanol concentration) was observed. In nonstressing situations, the strain PE-02 showed better growth; however, in stressing conditions of pH, ethanol and sugar concentrations, the strains of D. bruxellensis had better growth performance. The effective control of their growth could be obtained with a combined treatment of low pH (1.5) and ethanol (9%), however, a significant harmful effect to the S. cerevisiae strain was also verified, but in a lower extension. In batch system without cell recycle in synthetic medium, it was verified the influence of agitation over the ethanol and acid production by D. bruxellensis. The alcohol content was significantly higher when glucose was utilized instead of sucrose. In batch system with cell recycle in sugar cane juice, the best results for ethanol production, lower residual total reducing sugar and higher fermentative efficiency were obtained with the acid treatment of the ferment at pH 1.5, as well as a better growth control of the strain CCA155, in mixed culture with S. cerevisiae (PE-02). The acid treatment utilized in this work had effect not only over the growth of the contaminant yeast, but also benefited the yeast S. cerevisiae, resulting in the minimization of the effect of the contaminant over the fermentation developed in sugar cane juice medium in 12-hour ten fermentative cycles.

A poluição por metais pesados é um dos mais sérios problemas ambientais da atualidade devido tanto ao aumento de sua aplicação, como de sua natureza imutável. A importância em se estudar os metais, deve-se aos seus intensos efeitos tóxicos para o homem e todos os outros seres vivos. O cádmio é um metal não essencial e representa um grande potencial de danos a seres humanos e ao meio ambiente. A trealose é um dissacarídeo que participa como protetor em microrganismos em diferentes condições de estresses. Neste trabalho foi analisada a influência da trealose em resposta ao estresse oxidativo induzido pelo cádmio em linhagens de Saccharomyces cerevisiae. As linhagens utilizadas neste estudo são deficientes em genes importantes no metabolismo de trealose, na síntese (S. cerevisaie tps1) e na degradação (S. cerevisaie nth1) do dissacarídeo, desta forma foi possível analisar o papel da trealose frente ao estresse induzido pelo cádmio. Inicialmente, analisou-se o crescimento das linhagens em meio líquido com diferentes concentrações de cádmio, onde observou-se inibição no crescimento. A tolerância ao CdCl2 foi realizada através do plaqueamento, verificou-se que não existe formação de colônias em concentração superior a 25ppm. A incorporação de cádmio é maior quando foram usadas células viáveis coletadas na fase logarítmica. A linhagem tps1 possui uma incorporação de cádmio 3 vezes menor quando comparada às demais linhagens. A adição de glutationa reduzida ao meio extracelular não provocou alteração de incorporação de cádmio, porém ao adicionarmos aminoácidos (que formam a glutationa) ocorreu diminuição da incorporação em todas as linhagens. Quanto a formação de radicais livres intracelulares obtivemos que a linhagem tps1, possui um alto nível de oxidação celular mesmo na condição sem cádmio e quando exposta ao mesmo, apresentou um aumento na oxidação apesar de uma incorporação menor do metal que as demais linhagens. Análise da peroxidação lipídica realizada antes e após exposição das células ao cádmio, mostraram danos aos lipídeos. Observamos que células da linhagem nth1 (excesso de trealose) também sofrem esses danos, ou seja, a presença de um excesso de trealose não impediu a presença de danos aos lipídeos. Células da linhagem tps1 apresentaram maior dano lipídico que as demais linhagens evidenciando que, a ausência da trealose deixa os lipídeos mais susceptíveis a alterações deletérias. Procedeu-se também a análise da carbonilação de proteína onde observamos que na presença de cádmio não ocorreu carbonilação de proteínas, apenas a linhagem nth1 na concentração de 800ppm apresentou proteínas carboniladas, fato este relacionado a grande quantidade de radicais livres formados. As três linhagens após exposição à concentração de 50ppm de cádmio, apresentaram um aumento nos níveis de resíduos sulfidrílicos enquanto que na concentração de 800ppm apresentaram queda dos resíduos sulfidrílicos. Os resultados apresentados neste trabalho ajudaram a compreender o papel da trealose em células de S. cerevisiae frente ao estresse causado pelo cloreto de cádmio. / Pollution with heavy metals is one of the most serious environmental problems nowadays, which had in such a way to the increase of its application as, of its imutable nature. The importance of studying metals is directly related to intensive toxic effects to all living beings in our world. Cadmium is a non essential metal and represents a great danger to the human beings and also to the environmental. Trehalose is a disaccharide that participates as a protector in different conditions of stress. In this work the influence of trehalose in oxidative stress induced by cadmium was analyzed in different strains of Saccharomyces cerevisiae. The strains used in this study were not effective in important genes of the metabolism of trehalose, in the synthesis (S. cerevisaie tps1) and also in the degradation (S. cerevisaie nth1), so it was possible to analyze the performance of the trehalose in relation to the stress induced for cadmium. Initially the growth with different cadmium concentrations in medium liquid was analyzed, and the growth inhibition was observed. The tolerance to the CdCl2 was carried out by the growth on plates and one could observe that the formation was not present in concentrations up to 25ppm. Cells collected in the logarithmic phase had bigger cadmium incorporation. The strains tps1 presented a lower cadmium incorporation (3 times) when compared with other strains. The addition of reduced glutathione to the extracellular did not cause any alteration of in the cadmium incorporation, however, by adding amino acids, the ones which form glutathione, a reduction of the cadmium incorporation in all the strains occurred. The tps1 strains showed high level of cellular oxidation in control condition (without cadmium), and the cadmium incorporation showed an increase in the oxidation.Analyses of the lipid peroxidation carried out before and after exposition of the cells to cadmium showed damages to the lipids. We observe that cells of the strain nth1 (excess of trehalose) also suffer these damages. The presence of an excess of trehalose protected the lipids. Cells of the strain tps1 presented greater lipidic damage than the other strains, making clear that the absence of trehalose make the lipids more probable to have deleterious alterations. It was also performed a protein carbonilation analysis at cadmium presence and it did not induce a carbonilation of proteins. The stains nth1, whose concentration was 800ppm, presented carbonilated protein due to the high levels of ROS. The three strains after the exposition of 50ppm of cadmium showed an increase while on the concentration of 800ppm, it presented a drop on the levels of sulphydryl residues. The results presented in this work helped to understand the role of trehalose on Saccharomyces cerevisiae cells during cadmium stress.

Os microrganismos endofíticos vêm sendo estudados na busca de novas espécies e pela sua importância nas aplicações biotecnológicas. Podem ser isolados de sementes, raízes, folhas e em frutos de diversas espécies de plantas. Além disso, pouco se sabe a respeito desses microrganismos associados as folhas e frutos da melancia. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi isolar e identificar bactérias e leveduras endofíticas e associadas às folhas e frutos de melancia, assim como avaliar o potencial biotecnológico dos isolados de leveduras. As amostras foram obtidas de frutos oriundos de Brasília-DF e de plantas de Formoso do Araguaia-TO. Para o isolamento dos microrganismos foram adotados diferentes procedimentos para folhas: fragmentação e trituração, testando-se quatro condições de desinfestação superficial e para os frutos: trituração, enriquecimento e filtração em membrana. A identificação e caracterização molecular foi realizada pela técnica de PCR colony para bactérias e pela extração do DNA genômico de leveduras e bactérias. O DNA dos isolados foi amplificado utilizando oligonucleotídeos P027F e R1357 para bactérias, e NL1 e NL4 para leveduras. Para os isolados de leveduras foram realizados os testes de antagonismo contra oito fungos fitopatogênicos e a capacidade de produzir ácido indolacético (AIA). De acordo com resultados, foram obtidos 380 isolados de bactérias e 240 leveduras endofíticas e associadas, com maior número de isolados no tecido foliar, sendo identificadas 71 bactérias e 92 leveduras. Foram identificados 12 gêneros de bactérias, com o gênero Pantoea sp. isolado em maior quantidade. Para os isolados de leveduras, foram identificados 5 gêneros, com destaque para a espécie Sporidiobolus pararoseus, obtida de folhas e frutos de melancia. Os isolados de leveduras associadas TAIL 04 (99% Saccharomyces cerevisiae) e TAIL 63 (99% Pseudozyma antarctica) apresentaram atividade de antagonismo para os fungos Sclerotinia sclerotirum, Alternaria sp., Curvularia lunata, Rhizoctonia solane e Pyricularia oryzae. Este também foi inibido pelos isolados TAIL 95 (99% Hannaella sinensis) e TAIL 66 (100% Sporidiobolus pararoseus) e apresentou maior inibição de 32,82% com o isolado S. cerevisiae (TAIL 04). Simultaneamente, os isolados S. cerevisiae (TAIL 04) e P. antarctica (TAIL 04) mostraram capacidade em produzir ácido indolacético (AIA) nas concentrações de 21,14 μg/mL e 15,79 μg/mL, respectivamente, em após 7 dias de incubação. Conclui-se que folhas e frutos de melancia possuem importantes bactérias e leveduras endofíticas e associadas de interesse biotecnológico, como promotores de crescimento da planta e como antagonistas, possibilitando o seu uso no desenvolvimento de bioprodutos. / Endophytic microorganisms have been studied in the identification of new species and for their importante in biotechnological applications. Can be isolated them from seeds, roots, leaves and in fruits of several plant species. Besides, the relation between these microorganisms and watermelon leaves and fruits is far from being well known. Therefore, the main of this work was to identify both endophytic and associated bacteria and yeasts to leaves and fruits of watermelon, as well as evaluate biotechnological potential applications of yeast isolate. The samples were obtained of fruits from Brasília-DF and plants from Formoso do Araguaia-TO. For the isolation of the microorganisms were used different procedures for the leaves: fragmentation and crushing, by testing four surface disinfection conditions and for the fruits: crushing, enriching and filtration in membrane. Molecular identification and characterization was realized by the colony PCR technique for bacteria and the extraction of genomic DNA from yeasts and bactéria. The DNAs of the isolates was amplified using oligonucleotides P027F and R1357 for bacteria and NL1 and NL4 for yeast. For the yeasts isolate tests of antagonisms for phytopathogenic and producers of indoleacetic acid (AIA) were carried out. A total of 380 bacteria and 243 endophytic and associated yeasts were isolated, obtaining a higher number of isolates from the watermelon leaf tissue and 71 bacteria and 92 yeasts were identified. Twelve genus of bacterias were identified, with the gener Pantoea sp. isolated in larger quantity. For yeasts isolated were identified five genus, with featured for the specie Sporidiobolus pararoseus obtained of leaves and fruits of watermelon. Associated yeasts isolates TAIL 04 (99% Saccharomyces cerevisiae) and TAIL 63 (99% Pseudozyma Antarctica) showed antagonistic activity for the fungi Sclerotinia sclerotirum, Alternaria sp., Curvularia lunata, Rhizoctonia sp., Didymella sp. and Pyricularia oryzae. This also was inhibied by TAIL 95 (99% Hannaella sinensis) and TAIL 66 (100% Sporidiobolus pararoseus) isolated and showed greater inhibition of 32,82% with S. cerevisiae (TAIL 04). Simultaneously, S. cerevisiae (TAIL 04) and P. Antarctica (TAIL 63) showed capacity to producer indoleacetic acid (IAA) in concentrations of 21,14 μg/mL and 15,79 μg/mL, respectively, in 7 days of incubation. It is concluded that watermelon leaves and fruits have importants endophytics and associated bacterias and yeasts of biotechnological interest as grownth promoters and antagonistics, making possible their use in the development of bioproducts.

Devido à ampla utilização do cádmio nas indústrias, muitos solos encontram-se contaminados. Vários estudos com bioindicadores estão sendo realizados para detectar cádmio em solos, sendo a maioria com minhocas (Eisenia fetida) e plantas, contudo estes testes são laboriosos e longos. Os micro-organismos tem se mostrado uma alternativa promissora para esta aplicação, pois são de fácil cultivo e manutenção, além de apresentarem uma rápida resposta às alterações ambientais. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes gêneros de leveduras como bioindicadores de cádmio no solo. Para tanto foram avaliadas dezoito linhagens de leveduras, das quais foram selecionadas três quanto à sensibilidade na presença de cádmio. A levedura Torulopsis utilis var. thermophilus (IZ214) apresentou alta sensibilidade, a Candida utilis (IZ300) sensibilidade mediana e Saccharomyces cerevisiae (Pedra) a menor sensibilidade. O crescimento foi avaliado por espectrometria, através de leituras de D.O. e pela técnica do Trifeniltetrazólio (TTC) para avaliação da viabilidade celular. O uso do TTC mostrouse mais adequado nos bioensaios com leveduras evidenciando as células metabolicamente ativas. Foi avaliado o crescimento das leveduras em extratos de solo com cádmio obtidos pelo extrator CaCl2 0,01 mol L-1. Observou-se que o crescimento das leveduras na maioria dos tratamentos foi igual ou superior ao controle. Isso ocorreu devido à adsorção do cádmio à matéria orgânica e outros elementos. Para comprovar a adsorção do cádmio à matéria orgânica, foi realizado ensaio com a levedura S. cerevisiae (Pedra) onde ao extrato de solo obtido foi adicionado solução de Cd2+. Através da leitura de D.O. foi observada uma taxa de inibição de 75% para 100 mg L-1 de cádmio e, pela técnica do TTC, a taxa de inibição de 100% ocorreu na concentração de 44 mg L-1. Ensaios com sementes foram realizados para avaliar a germinação e crescimento na presença de cádmio. Sementes de Cucumis sativus foram expostas à solução de Cd2+, ocorrendo 100% de germinação e apresentando DL50 de 7,33 mg L-1. Este resultado foi maior comparado aos obtidos para as leveduras avaliadas, as quais apresentaram uma DL50 de 0,89 mg L-1 para a levedura T. utilis (IZ214) e DL50 de 1,86 mg L-1 para a S. cerevisiae (Pedra). As sementes de Zea mays foram expostas ao extrato de solo com cádmio, onde foi obtido uma DL50 de 33,9 ± 3,0 mg L-1 e, nas mesmas condições para a levedura S. cerevisae (Pedra), a DL50 foi de 29,8 mg L-1. Os resultados obtidos mostraram uma proximidade de valores nos ensaios com extrato de solo com cádmio entre a semente de milho e levedura. Com isso, foi possível concluir que as leveduras são sensíveis ao cádmio e podem ser uma nova opção de bioindicadores. Além disso, as leveduras e principalmente a S. cerevisiae possuem um alto grau de homologia com os eucariotos superiores, permitindo assim o estudo de aspectos de toxicidade relevantes a biologia humana. / Due to extensive use of cadmium in industries, many soils are contaminated. Several studies are being conducted with biomarkers to detect cadmium in soils, mostly with earthworms (Eisenia fetida) and plants, however, these tests are laborious and lengthy. Micro-organisms have been presented as an alternative to this application, as they are easy to grow and maintain, and offer a rapid response to environmental changes. Thus, the aim of this study was to use different kinds of yeasts as indicators of cadmium in soil. Eighteen yeasts strains were evaluated, from which three were selected for their sensitivity in the presence of cadmium. The yeast Torulopsis utilis var. thermophilus (IZ214), showed high sensitivity, Candida utilis (IZ300), showed a median sensitivity and Saccharomyces cerevisiae (Ale Yeast) a showed lower sensitivity. Yeasts growth was assessed through spectrophotometry, by reading O.D. and by the technique Triphenyltetrazolium (TTC) to assess cell viability. The use of TTC was more appropriate as an indicator of cell viability in yeast bioassays showing metabolically active cells. We evaluated the growth of yeasts in soil extracts with cadmium obtained by extraction with CaCl2 0.01 mol L-1. It was observed that the growth of the yeast on most of the treatments was equal or superior to the control. This was due to the adsorption of cadmium to organic matter and other elements. To prove the adsorption of cadmium to organic matter, an essay was performed with the yeast S. cerevisiae (Ale Yeast), in which the soil extract solution obtained was added with Cd2+. By reading the O.D. it was observed an inhibition rate of 75% for 100 mg L- 1 cadmium and, by the TTC technique, the highest rate of 100% inhibition occurred at a concentration of 44 mg L-1. Seeds trials were conducted to evaluate germination and growth. Cucumis sativus seeds were exposed to a solution of Cd2+, resulting in 100% of germination and showing a LD50 of 7.33 mg L-1, which was greater than the one measured for yeasts, who had an LD50 of 0.89 mg L-1 to the yeast T. utilis (IZ214) and LD50 of 1.86 mg L-1 for S. cerevisiae (Ale Yeast). The seeds of Zea mays were exposed to soil extract containing cadmium, in which it was noticed a LD50 of 33.9 ± 3.0 mg L-1 and, by having the same conditions for the yeast S. cerevisiae (Ale Yeast), the LD50 was of 29.8 mg L-1. The results showed similar values in tests with soil extract with cadmium comparing the corn seed and the yeast. Thus, it was concluded that the yeasts are sensitive to cadmium and may be a new option bioindicators. Also, yeasts, in special S. cerevisiae, have a high degree of homology with higher eukaryotes, therefore allowing the study of relevant toxicity aspects in human biology.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 italo.pdf: 843750 bytes, checksum: 971dc2983746976f9e3b4bd789755fb5 (MD5) Previous issue date: 2010-03-04 / Yeasts were isolated from different Amazon habitat: beetles gut (Carabidae), midgut and hindgut of Nasutitermes sp., soil samples from savanna (Boa Vista city, Roraima state) and Amazon rain forest. The yeasts were selected according to the capability of metabolize sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate (HACA) as one carbon source, assimilate and fermenting D-xylose. To selective medium preparation, HACA was diluted until reducing sugar concentration was 1% and supplemented with Yeast Nitrogen Base (YNB 6,7 g/L) and Agar (20 g/L). Xylose assimilating ability was investigated using replica-plating, as described by Barnett et al. (1990), using D-xylose (50 mM), YNB (6,7 g/L) and Agar (20 g/L). Fermenting capability was evaluated using flasks with 10 mL of YUKX medium (Yeast extract 1,5 g/L; Urea 1,25 g/L; KH2PO4 1,1 g/L and D-xylose 50 g/L), containing a Durham tube. Another fermentation test was performed using Falcon® tubes (50 mL) with 10 mL of YUKX, sealed with rubber stopper. A valve allowed CO2 liberation as fermentative evidence. A number of 76 colonies were isolated (2 from savanna, 8 from rain forest, 12 from Carabidae and 54 from Nasutitermes sp.), among these were detected 28 that have ability to growth on D-xylose as unique carbon source and 3 were able to ferment that sugar. These results agree with Breznak (1982) and Blackwell et al. (2004), which consider that insect gut (as termites and beetle) is a rich source of microorganisms that metabolize hemicelluloses for biotechnology purpose. Three D-xylose fermenting strains isolated from Amazon insects (LC27, IB04 and IB09) were cultivated at HACA and YUKX medium. The cell growth and sugar consumption were evaluated using OD600 and DNS methods, respectively. Thermo tolerance and ethanol tolerance were investigated using heat-shock (52 ºC, 9 minutes) and ethanol-shock (YPD + 20% ethanol during one week), evaluating cell viability. A fermenting assay was performed, monitoring CO2 releasing to estimate ethanol production. Sugar consumption was 78,3% at HACA medium, while at YUKX was 55,9%. Both strains are able to do hemicellulosic hydrolysate saccharification, raising reducing sugar from 42,5 g/L up to 63 g/L. The cell viability after heat-shock was upper 85% for IB04 and IB09 strains, but LC27 had a cell-viability lower than 40%. The cultivation after ethanol shock shows tolerance by all tested strains. The fermenting assay allows estimate low ethanol yield, average about 3,34 g/L. These results indicate potential for biotechnological using of hemicellulosic derived. / Foram isoladas leveduras a partir de diferentes habitats amazônicos, a saber, intestino de besouros da família Carabidae, conteúdo abdominal de cupins (Nasutitermes sp.), amostras de solos coletados em áreas de savanas (formação geomorfológica Boa Vista RR) e em matas de terra firme (Manaus AM). As leveduras foram isoladas segundo a capacidade de crescer invitro usando hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (HACA) como fonte única de carbono, sendo selecionadas aquelas que fossem capazes de assimilar e fermentar D-xilose. Para tanto se utilizou meio de cultura composto por hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (concentração de açúcar redutor total ajustada para 1%), suplementado por Yeast Nitrogen Base (YNB 6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade de assimilar D-xilose foi atestada pela técnica replica-plating, descrita por Barnett et al. (1990), cultivando as colônias isoladas em placas de Petri contendo D-xilose (50 mM), YNB (6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade fermentativa foi testada em tubos de ensaio contendo meio YUKX líquido, composto por extrato de leveduras (1,5 g/L), uréia (1,25 g/L), KH2PO4 (1,1 g/L) e D-xilose (50 g/L). Em cada tubo de ensaio foi adicionado um tubo de Durham para retenção de gás liberado pela fermentação. Outro teste qualitativo de fermentação foi efetuado, cultivando as leveduras em tubos Falcon® de 50 mL contendo 10 mL de YUKX. Os tubos foram vedados com rolhas de borracha contendo um orifício fechado por uma mangueira. Após sete dias de cultivo, a mangueira foi aberta dentro de uma coluna de água, para evidenciar o desprendimento de gás pela atividade fermentativa. Foram isoladas ao todo 76 colônias de leveduras, sendo duas associadas a solos de savana, oito associadas a solos de florestas de terra firme, 12 associadas a besouros da familia Carabidae e 54 associadas à Nasutitermes sp. Dentre estas, 28 foram capazes de assimilar D-xilose e três capazes de fermentar o referido açúcar, sendo duas associadas à Carabidae e uma a Nasutitermes sp. Estes resultados concordam com o que foi escrito anteriormente por Breznak (1982) e Blackwell (2004), os quais consideram que o trato digestivo de insetos xilófagos é uma rica fonte de microrganismos de interesse biotecnológico. As três linhagens de leveduras, fermentadoras de D-xilose (LC27, IB04 e IB09) foram cultivadas em YUKX e em HACA, a fim de caracterizá-las quanto ao crescimento celular (mensurando a densidade ótica / λ = 600 nm) e o consumo de açúcar redutor (quantificado pelo método DNS). O ensaio em fermentômetro foi executado para avaliação da perda de massa por desprendimento de CO2 a fim de se estimar a produtividade de etanol. Avaliou-se ainda a termotolerância (choque térmico a 52 ºC por 9 minutos) e tolerância ao etanol (cultivo estacionário por 7 dias em YPD + 20% etanol). Todos os experimentos foram feitos em duplicata, com pH inicial 5,5 e temperatura a 35 ºC. O consumo de açúcar redutor total em HACA foi em média de 78,3%, enquanto que em YUKX o consumo médio foi de 55,9%. Quando cultivadas em HACA, as linhagens demonstraram ainda potencial de sacarificação, elevando a concentração de ART em até 48% durante as primeiras 8 horas de cultivo. As linhagens IB04 e IB09 são termotolerantes, apresentando viabilidade celular superior a 85%, enquanto que LC27 esses valores foram inferiores a 40%. O teste de tolerância ao etanol demonstrou resistência pelas três linhagens, com média de 81 unidades formadoras de colônia nas primeiras 24 horas, tornando-se incontáveis a partir das 48 horas. A evolução de CO2 (valor médio de 3,2 g/L) permite estimar produção de etanol, mas com baixo rendimento, com estimativa de 3,34g/L. Todas apresentam potencial para utilização em processos biotecnológicos usando hidrolisado hemicelulósico como substrato.