Orientadora: Profª Dra Alexandre Hiroaki Kihara / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2014. / No desenvolvimento pós-natal do Sistema Nervoso Central (SNC), a formação do bulbo olfatório ocorre a partir da zona subventricular (ZSV) próxima ao ventrículo lateral, por meio da proliferação e migração dos neurônios formados nestas regiões em idade pós-natal. As atividades das células das ZSV são moduladas pela variação da concentração de cálcio intracelular, que por sua vez é dependente do cálcio externo e de estoques intracelulares deste íon localizados em organelas como o retículo endoplasmático e mitocôndria. Estas organelas expressam receptores de rianodina (RyRs) que controlam a liberação do cálcio para o citosol. O objetivo deste projeto foi verificar a expressão destes receptores e, consequentemente, a participação do cálcio intracelular no desenvolvimento das células da ZSV de ratos da cepa Wistar. Para este fim, primeiramente foi realizada análise da expressão gênica dos RyRs na ZSV de ratos neonatos no dia do nascimento (P0) e animais adultos (P60), além da distribuição proteica dos RyRs em ratos P0; posteriormente, foi realizado o bloqueio in vitro dos RyRs em células da ZSV, extraídas de animais P0, com dantrolene por um período de 4 horas. Após o bloqueio, foram avaliadas possíveis alterações i) na morfologia das células; ii) desenvolvimento de neuritos. Para isto, foram utilizadas técnicas combinadas como imuno-histoquímica, PCR em tempo real, além de avaliações morfológicas. Na parte descritiva, verificamos menor expressão gênica em neonatos em relação aos animais adultos e acumulo proteico das três isoformas de RyRs na ZSV de neonatos, enquanto que o bloqueio das células em meio de cultura inibiu a formação de neuritos assim como as células mantiveram-se com morfologia circular, diferentemente de células controle, que apresentaram morfologia diferencial e maior arborização dendrítica. Assim, podemos concluir que os RyRs participam do processo de desenvolvimento das células da ZSV, as quais migram e formam as circuitarias do bulbo olfatório. / During the development of the central nervous system (CNS), the formation of the olfactory bulb occurs through the proliferation and migration of postnatal differentiated neurons from the subventricular zone (SVZ) close to the lateral ventricle. The activity of SVZ cells is modulated by the variation of intracellular calcium concentration, which in turn depends on external calcium and intracellular stores, localized in organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum. These organelles accumulate ryanodine receptors (RyRs) that control the release of calcium into the cytosol. The aim of this project was to verify the role of these receptors and, consequently, the participation of intracellular calcium in the development of the SVZ cells from Wistar rats. To this end, we first analyzed gene expression of these receptors in neonates animals (P0) and adult animals (P60) and also descriptive analysis related to the protein distribution in the SVZ of neonate animals in the day of birth (P0). Then we performed in vitro blockade of RyRs in SVZ cells, isolated from P0 animals with dantrolene during 4 hours. After the blockade, possible alterations were evaluated i) cell morphology; ii) neurite growth. For this, combined techniques such as immunohistochemistry and real time PCR were used, besides morphological evaluations. We observed gene expression of the three isoforms of RyRs in neonates lower than in adults, and protein accumulation of these proteins in all SVZ from neonates. In vitro blockade of RyRs in primary cell culture from SVZ inhibited the neurite growth, as well as preserved the circular morphology of the treated cells, contrary to the observed in control cells, which showed differentiated shape and increased dendritic branching. Thus, we are able to disclose that RyRs participate in the development of the cells from SVZ, which migrate and participate the olfactory bulb circuitries.

O presente trabalho relata a identificação de áreas neurogênicas, o cultivo, identificação e caracterização de precursores neurais obtidos do encéfalo de fetos de cobaias. Áreas potencialmente neurogênicas no encéfalo de neonatos foram identificadas por imunohistoquímica para a bromodeoxiuridina (BrdU), após inoculação da droga. A incorporação de BrdU foi detectada principalmente em células das áreas subjacentes ao ventrículo lateral, hipocampo e bulbo olfatório, indicando proliferação celular e sugerindo o potencial neurogênico dessas áreas. A seguir, realizou-se o cultivo de precursores neurais a partir da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais. Após aproximadamente uma semana de cultivo, as células da SVZ em multiplicação ativa originaram abundantes massas celulares (neuroesferas, NSFs). Células dissociadas a partir das NSFs primárias foram capazes de gerar novas neuroesferas após alguns dias de cultivo. As NSFs proliferaram em número e em tamanho, podendo ser subcultivadas por até 5-6 passagens, com intervalos de uma semana, permanecendo viáveis por até 60 dias. Nesse período, as NSFs foram congeladas e descongeladas, tendo sido preservadas a sua viabilidade e capacidade proliferativa. Ensaios de viabilidade pelo método colorimétrico de MTT revelaram diferenças de viabilidade entre NSFs cultivadas a partir de SVZs de animais de diferentes idades (fetos, 7, 30 e 180 dias de vida). NSFs dissociadas apresentaram cerca de 2,3% de morte celular por apoptose e cerca de 3,1% de morte por necrose. NSFs íntegras e dissociadas foram submetidas a imunofluorescência (IF), utilizando-se anticorpos para marcadores de células-tronco (nestina), neurônios (Beta-III-tubulina), oligodendrócitos (mGALC) e astrócitos (GFAP). Marcação difusa, de intensidade variável, foi observada no citoplasma de células das NSFs e nas células individualizadas, mas o percentual de células expressando os diferentes marcadores não foi determinado. Quando cultivadas em meio contendo B27, sem fatores de crescimento, as NSFs apresentaram evidências de diferenciação, originando células aderentes a superfície do frasco, com características morfológicas diferentes as das NSFs, indicando diferenciação. Citometria de fluxo de células das NSFs após a diferenciação revelou 13,3% positivas para nestina, aproximadamente 5,5% positivas para beta-III-tubulina, 9% positivas para GFAP e 7,8% positivas para mGalC. Células diferenciadas foram então submetidas a teste de funcionalidade, pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato. A adição de GABA e glutamato resultou em estimulação de algumas células diferenciadas, que foi observado por meio do aumento da fluorescência das mesmas. Portanto, células cultivadas e diferenciadas in vitro a partir da SVZ de fetos de cobaias apresentam indicadores funcionais de neurônios. A capacidade das células da SVZ de fetos cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora no sentido de aprofundar as pesquisas e viabilizar o uso terapêutico de células-tronco em disordens do sistema nervoso. / The present study concerns the identification of neurogenic areas, culture, identification and characterization of neural precursors obtained from the brain of guinea pigs. Potentially neurogenic areas in the brain of neonates were identified by immunohistochemistry for bromodeoxyuridine (BrdU), following administration of the drug. BrdU incorporation was detected mainly in cells underlying the lateral ventricle, in hippocampus and olfactory bulbs, indicating cell proliferation and suggesting a neurogenic potential for these areas. Subsequently, neural precursors were cultured from cells obtained from the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. After approximately one week culture, SVZ cells in active multiplication originated abundant cellular masses (neurospheres, NSFs). Cells dissociated from primary NSFs were capable of originating new NSFs after a few days of culture. NSFs proliferated in number and size, allowing 5-6 weekly subculturings and maintaining growth and viability for up to 60 days. In the meantime, NSFs were frozen and thawed, maintaining the viability and proliferative ability. Viability assays by the colorimetric MTT revealed viability differences among NSFs originated from SVZs from animals of different ages (fetuses, 7, 30 and 180 days of age). Dissociated NSFs underwent approximately 2.3% cell death by apoptosis and 3.1% death by necrosis. Intact and dissociated NSFs were submitted to immunofluorescence (IF), using antibodies for cell markers of stem cells (nestin), neurons (beta-III tubulin), oligodendrocytes (mGalC) and astrocytes (GFAP). A diffuse staining of variable intensity was observed in the cytoplasm of NSFS and dissociated cells, yet the rate of cells expressing each individual marker could not be determined. Upon culture in medium containing B27, without NSFs-specific growth factors, NSFs displayed evidence of neural differentiation, originating cells with morphology distinct from that of NSFs, suggesting differentiation. Flow cytometry analysis of NSFs cells after differentiation revealed approximately 13.3% positive for nestin, around 5.5% positive for beta-III-tubulin, 9% GFAP positive and approximately 7.8% positive for mGalC. Differentiated cells were then submitted to a functional test, by measuring calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli. GABA and glutamate stimulated some differentiated cells. Thus, cells cultured and differentiated from guinea pig SVZ present physiological indicators of neuronal physiology. Thus, the ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising towards further studies and potential therapeutic use of neural stem cells in disorders of the nervous system.

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Ao longo de toda a vida, os progenitores neuronais gerados destinam-se ao bulbo olfat?rio (BO) para onde migram atrav?s da via migrat?ria rostral (RMS). Uma vez no BO, os novos neur?nios se diferenciam em neur?nios GABA?rgicos que integram-se ? circuitaria local. A express?o de GABA inicia ainda na zona germinativa. Essa express?o precoce poderia levar a hip?tese de que estes progenitores j? estariam comprometidos com o fen?tipo GABA?rgico. Por?m, para demonstrar seu comprometimento GABA?rgico, um dos passos necess?rios ? mostrar que a descarboxilase do ?cido glut?mico (GAD), a enzima que sintetiza GABA em neur?nios maduros, est? presente nestas c?lulas. Nesta tese mostramos que a express?o e atividade enzim?tica de GAD, s?o muito baixas na SVZ. Revelamos que o GABA presente em neur?nios imaturos da SVZ prov?m de uma via de s?ntese alternativa, a via da putrescina. Para analisar a import?ncia do GABA proveniente de putrescina para estas c?lulas realizamos a inibi??o farmacol?gica de sua s?ntese atrav?s da administra??o de DFMO. Observamos que o tratamento com DFMO regula positivamente a express?o de GAD na SVZ e RMS. Mostramos tamb?m que os neuroblastos da SVZ que expressam GABA s?o realmente pl?sticos quanto a sua escolha de fen?tipo neuroqu?mico. Quando explantes de SVZ s?o co-cultivados com fatias de telenc?falo embrion?rio dorsal, s?tio de gera??o de neur?nios glutamat?rgicos, uma subpopula??o se diferencia em neur?nios GABA?rgicos e outra menor em glutamat?rgicos. Sugerimos, portanto, que a via da putrescina permite que neur?nios imaturos sintetizem GABA sem, no entanto, haver comprometimento com o fen?tipo GABA?rgico. Esta produ??o de GABA parece ser importante para a migra??o de neuroblastos da SVZ, embora n?o tenhamos tido sucesso em mostrar um papel na prolifera??o com o decr?scimo na produ??o do precursor putrescina. Mostramos que a libera??o de GABA de putrescina parece ter um papel em inibir a express?o de GAD nestes neuroblastos. Em contrapartida, a subregula??o desta sinaliza??o levaria ao comprometimento pelo fen?tipo GABA?rgico. Se mudarmos os sinais apresentados ?s c?lulas da SVZ, como ?queles presentes na VZ do telenc?falo embrion?rio, pelo menos uma de suas subpopula??es ? capaz de mudar seu destino fenot?pico, e diferenciar-se em neur?nios glutamat?rgicos piramidais. / The subventricular zone (SVZ) is proliferative epithelium that continuously gives rise to new neurons in postnatal and adult mammals. The neurons generated in the SVZ migrate through the rostral migratory stream (RMS) where they differentiate in GABAergic interneurons. A characteristic of these neuron precursors is that they start to express GABA while they are still in the SVZ. This fact can lead to the conclusion that at this time they are already commited to the GABAergic phenotype. However, to affirm this one has to show that the origin of GABA in these cells is the same as in mature neurons. One of the most important steps to define GABAergic commitment in neurons is to demonstrate the expression of glutamic acid decarboxylase (GAD), the synthetic enzyme for GABA in mature neurons. Here we show that SVZ cells display low levels of GAD immunocytochemistry and enzyme activity as compared with the olfactory bulb. We also show that these cells are able to synthesize GABA using an alternative source, the putrescine pathway. To test the importance of putrescine made GABA in vivo, we pharmacolgically inhibited putrescine synthesis through DFMO administration. We observed that this treatment lead to an increase of GAD expression in the SVZ and RMS. We also show here that SVZ cells can display phenotypic plasticity. Co-culturing SVZ explants and dorsal telencephalic slices, a spot of glutamatergic neurogenesis, we observed that a subpopulation of SVZ derived neurons differentiated into GABAergic neurons and another into glutamatergic pyramidal neurons. Our working hypothesis is that the putrescine pathway is a mechanism to synthesize GABA without commitment to the GABAergic phenotype. The release of putrescine derived GABA inhibits GAD expression leaving these neuroblasts in an undifferentiated state. The inhibition of putrescine synthesis caused an upregulation of GAD expression which would lead to GABAergic commitment. If we present these neuroblasts with different signals, as those present in the embryonic dorsal telencephalon, they would show plasticity in their phenotypic fate and differentiate into other neurochemical and morphological phenotypes, one of which is the glutamatergic pyramidal neuron.

O presente trabalho relata a identificação de áreas neurogênicas, o cultivo, identificação e caracterização de precursores neurais obtidos do encéfalo de fetos de cobaias. Áreas potencialmente neurogênicas no encéfalo de neonatos foram identificadas por imunohistoquímica para a bromodeoxiuridina (BrdU), após inoculação da droga. A incorporação de BrdU foi detectada principalmente em células das áreas subjacentes ao ventrículo lateral, hipocampo e bulbo olfatório, indicando proliferação celular e sugerindo o potencial neurogênico dessas áreas. A seguir, realizou-se o cultivo de precursores neurais a partir da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais. Após aproximadamente uma semana de cultivo, as células da SVZ em multiplicação ativa originaram abundantes massas celulares (neuroesferas, NSFs). Células dissociadas a partir das NSFs primárias foram capazes de gerar novas neuroesferas após alguns dias de cultivo. As NSFs proliferaram em número e em tamanho, podendo ser subcultivadas por até 5-6 passagens, com intervalos de uma semana, permanecendo viáveis por até 60 dias. Nesse período, as NSFs foram congeladas e descongeladas, tendo sido preservadas a sua viabilidade e capacidade proliferativa. Ensaios de viabilidade pelo método colorimétrico de MTT revelaram diferenças de viabilidade entre NSFs cultivadas a partir de SVZs de animais de diferentes idades (fetos, 7, 30 e 180 dias de vida). NSFs dissociadas apresentaram cerca de 2,3% de morte celular por apoptose e cerca de 3,1% de morte por necrose. NSFs íntegras e dissociadas foram submetidas a imunofluorescência (IF), utilizando-se anticorpos para marcadores de células-tronco (nestina), neurônios (Beta-III-tubulina), oligodendrócitos (mGALC) e astrócitos (GFAP). Marcação difusa, de intensidade variável, foi observada no citoplasma de células das NSFs e nas células individualizadas, mas o percentual de células expressando os diferentes marcadores não foi determinado. Quando cultivadas em meio contendo B27, sem fatores de crescimento, as NSFs apresentaram evidências de diferenciação, originando células aderentes a superfície do frasco, com características morfológicas diferentes as das NSFs, indicando diferenciação. Citometria de fluxo de células das NSFs após a diferenciação revelou 13,3% positivas para nestina, aproximadamente 5,5% positivas para beta-III-tubulina, 9% positivas para GFAP e 7,8% positivas para mGalC. Células diferenciadas foram então submetidas a teste de funcionalidade, pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato. A adição de GABA e glutamato resultou em estimulação de algumas células diferenciadas, que foi observado por meio do aumento da fluorescência das mesmas. Portanto, células cultivadas e diferenciadas in vitro a partir da SVZ de fetos de cobaias apresentam indicadores funcionais de neurônios. A capacidade das células da SVZ de fetos cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora no sentido de aprofundar as pesquisas e viabilizar o uso terapêutico de células-tronco em disordens do sistema nervoso. / The present study concerns the identification of neurogenic areas, culture, identification and characterization of neural precursors obtained from the brain of guinea pigs. Potentially neurogenic areas in the brain of neonates were identified by immunohistochemistry for bromodeoxyuridine (BrdU), following administration of the drug. BrdU incorporation was detected mainly in cells underlying the lateral ventricle, in hippocampus and olfactory bulbs, indicating cell proliferation and suggesting a neurogenic potential for these areas. Subsequently, neural precursors were cultured from cells obtained from the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles. After approximately one week culture, SVZ cells in active multiplication originated abundant cellular masses (neurospheres, NSFs). Cells dissociated from primary NSFs were capable of originating new NSFs after a few days of culture. NSFs proliferated in number and size, allowing 5-6 weekly subculturings and maintaining growth and viability for up to 60 days. In the meantime, NSFs were frozen and thawed, maintaining the viability and proliferative ability. Viability assays by the colorimetric MTT revealed viability differences among NSFs originated from SVZs from animals of different ages (fetuses, 7, 30 and 180 days of age). Dissociated NSFs underwent approximately 2.3% cell death by apoptosis and 3.1% death by necrosis. Intact and dissociated NSFs were submitted to immunofluorescence (IF), using antibodies for cell markers of stem cells (nestin), neurons (beta-III tubulin), oligodendrocytes (mGalC) and astrocytes (GFAP). A diffuse staining of variable intensity was observed in the cytoplasm of NSFS and dissociated cells, yet the rate of cells expressing each individual marker could not be determined. Upon culture in medium containing B27, without NSFs-specific growth factors, NSFs displayed evidence of neural differentiation, originating cells with morphology distinct from that of NSFs, suggesting differentiation. Flow cytometry analysis of NSFs cells after differentiation revealed approximately 13.3% positive for nestin, around 5.5% positive for beta-III-tubulin, 9% GFAP positive and approximately 7.8% positive for mGalC. Differentiated cells were then submitted to a functional test, by measuring calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli. GABA and glutamate stimulated some differentiated cells. Thus, cells cultured and differentiated from guinea pig SVZ present physiological indicators of neuronal physiology. Thus, the ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising towards further studies and potential therapeutic use of neural stem cells in disorders of the nervous system.