Anders als menschengemachte Maschinen verfügen Zellen über keinen festgeschriebenen Bauplan und die Positionen einzelner Elemente sind häufig nicht genau festgelegt, da die Moleküle diffusiven Zufallsbewegungen unterworfen sind. Darüber hinaus sind einzelne Bauteile auch nicht auf eine einzelne Funktion festgelegt, sondern können parallel in verschiedene Prozesse einbezogen sein. Basierend auf Selbstorganisation und Selbstassemblierung muß die Organisation von Anordnung und Funktion einer lebenden Zelle also bereits in ihren einzelnen Komponenten inhärent enthalten sein. Die intrazelluläre Organisation wird zum großen Teil durch ein internes Biopolymergerüst reguliert, das Zytoskelett. Biopolymer-Netzwerke und –Fasern durchdringen die gesamte Zelle und sind verantworlich für mechanische Integrität und die funktionale Architektur. Unzählige essentielle biologische Prozesse hängen direkt von einem funktionierenden Zytoskelett ab. Die vorliegende Arbeit zielt auf ein besser Verständnis und den Nachbau zweier verschiedener funktionaler Module lebender Zellen anhand stark reduzierter Modellsysteme. Als zentrales Element wurde Aktin gewählt, da dieses Biopolymer eine herausragende Rolle in nahezu allen eukaryotischen Zellen spielt. Mit dem ersten Modellsystem wird der bewegliche Aktin-Polymerfilm an der Vorderkante migrierender Zellen betrachtet. Die wichtigsten Elemente dieser hochdynamischen Netzwerke sind bereits bekannt und wurden in dieser Arbeit benutzt um ein experimentelles Modellsystem zu etablieren. Vor allem aber lieferten detailierte Computersimulationen und ein mathematisches Modell neue Erkenntnisse über grundlegende Organisationsprinzipien dieser Aktinnetzwerke. Damit war es nicht nur möglich, experimentelle Daten erfolgreich zu reproduzieren, sondern das Entstehen von Substrukturen und deren Charakteristika auf proteinunabhängige, generelle Mechanismen zurückzuführen. Das zweite studierte System betrachtet die Selbstassemblierung von Aktinnetzwerken durch entropische Kräfte. Aktinfilamente aggregieren hierbei durch Kondensation multivalenter Ionen oder durch Volumenausschluss hochkonzentrierter inerter Polymere. Ein neu entwickelter Experimentalaufbau bietet die Möglichkeit in gut definierten zellähnlichen Volumina, Konvektionseinflüsse zu umgehen und Aggregationseffekte gezielt einzuschalten. Hierbei wurden neuartige, regelmäßige Netzwerkstrukturen entdeckt, die bislang nur im Zusammenhang mit molekularen Motoren bekannt waren. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die Physik der Flüssigkristalle entscheidend zu weiteren Variationen dieser Netzwerke beiträgt. Dabei wird ersichtlich, dass entstehende Netzwerke in ihrer Architektur direkt die zuvor herrschenden Anisotropien der Filamentlösung widerspiegeln.:1 Introduction 1 2 General background 7 2.1 General concepts 7 2.1.1 Coarse-graining as hierarchical reduction 8 2.1.2 Functional modules and redundancies 10 2.1.3 Emergence 11 2.1.4 Self-organization and self-assembly 13 2.1.5 Bottom-up and top-down 13 2.2 The cytoskeleton 15 2.2.1 From actin monomers to filaments 16 2.2.2 Accessory proteins and actin networks 21 2.3 Biopolymer pattern formation 25 2.3.1 Random networks and nematic phases 25 2.3.2 Linker and motor induced networks 28 3 Lamellipodial actin network formation 33 3.1 Background: crawling cell migration 33 3.1.1 Leading edge actin structures 35 3.1.2 Lamellipodial self-organization into oriented branches? 40 3.1.3 Lamellipodial modeling 41 3.1.4 Beyond the lamellipodium: adhesion and network contraction 42 3.2 Methods: lamellar treadmilling model 45 3.2.1 Assumptions 45 3.2.2 Choice of model parameters 51 3.2.3 Computer simulation (implementation) 52 3.2.4 Mathematical modeling 56 3.3 Modeling results 63 3.3.1 Reproduction of motile cell characteristics 64 3.3.2 Self-organization into lamellipodium and lamellum 65 3.3.3 Filament severing and annealing influence network properties 70 3.3.4 Unconfined network growth 74 3.4 Feasible model extensions 76 3.4.1 Alternative nucleation mechanisms 77 3.4.2 Convergence zone through myosin-driven network contraction 80 3.5 Experimental bottom-up approach 82 3.6 Discussion: Arp2/3 induced actin networks 87 4 Actin network patterns in confined systems 91 4.1 Background: counterion condensation and depletion forces 91 4.1.1 Actin, a polyelectrolyte: counterion condensation 92 4.1.2 Actin and molecular crowding: depletion forces 95 4.2 Methods: Experimental design and data analysis 97 4.2.1 Protein purification and handling 98 4.2.2 Droplet formation 98 4.2.3 Volume monitoring and pattern analysis 100 4.3 Actin pattern formation 105 4.3.1 Counterion-induced network formation 105 4.3.2 Depletion force induced network formation 111 4.4 First modeling attempts: bundling simulation 116 4.4.1 Model concept and assumptions 116 4.5 Discussion: Counterion and depletion-based network assembly 119 5 Discussion & Outlook 125 Appendix 129 A. Variation of filament orientation 129 B. Analytical solution of the mathematical model 131 C. Pre-alignment of filaments 132 D. Protocols 134 d1. Acetone Powder Prep 134 d2. Actin prep 135 d3. Actin labling with rhodamine dye 137 Bibliography 141 Acknowledgements 157

Shigellen sind enteroinvasive E. coli-Klone, die beim Menschen das Krankheitsbild der bakteriellen Ruhr verursachen. Wichtige Virulenzeigenschaften dieser Bakterien werden von dem 220 kb großen Plasmid pINV kodiert. Die für das Krankheitsbild typischen blutig-eitrigen Durchfälle sind Folge der retrograden Zerstörung der Kolon-Mukosa ausgehend von der initialen Infektion im Bereich des Recto-Sigmoids. Die Infektion der Darmmukosa erfolgt über M-Zellen und assoziierte Makrophagen, nach deren apoptotischem Untergang das Bakterium Zugang zum basolateralen Pol der Enterozyten erhält; eine direkte Infektion der Enterozyten vom Darmlumen über deren apikalen Pol wird nicht beobachtet. Das eigentliche Ziel der invasiven Shigellen ist das Zytoplasma des Enterozyten, da nur dort eine relevante Replikation der Bakterien stattfindet. Dabei wird die Ausbreitung der Bakterien durch ihre Fähigkeit begünstigt, von einer primär infizierten Epithelzelle ausgehend benachbarte Epithelzellen über Plasmamembran-Ausstülpungen zu infizieren, ohne dabei den geschützten Raum des epithelialen Zytoplasmas zu verlassen. Die Aufklärung des epithelialen Invasionsmechanismus auf molekularer Ebene ist deshalb von essenzieller Bedeutung für das Verständnis sowohl der Pathogenese der Erkrankung als auch der Ökologie des Erregers. Die Infektion humaner Epithelzellen durch Shigellen erfolgt durch bakterielle Induktion von Membranausstülpungen, die über dem Bakterium fusionieren und morphologisch der Makropinozytose ähneln. Die Ausbildung der zellulären Protrusionen geht mit bedeutenden Umbauvorgängen des Zytoskeletts einher. Wir konnten zunächst in einer mikromorphologischen Analyse die einzelnen Etappen des Zytoskelett-Umbaus sowie die Mikroarchitektur der Protrusionen beschreiben. Anschließend gelang es, mit T-Plastin, Rho und einem Myosin IX Struktur- und Regulations-Moleküle zu identifizieren, die für die bakterielle Invasion funktionell bedeutend sind. Dabei fielen unterschiedliche bakteriell induzierte Rekrutierungsmuster verschiedener Rho-Isoformen und verschiedener Proteine der Rho-Familie auf. Insbesondere wurden RhoA und RhoC in unterschiedliche Bereiche des Invasionskomplexes rekrutiert. Mit umfangreichen Mutationsanalysen dieser Rho-Isoformen gelang es schließlich erstmals, ein humanes Proteinmotiv mit Techniken der `zellulären Mikrobiologie´ zu charakterisieren. Das mit Hilfe unseres Shigellen-Infektionsmodells an Epithelzellen beschriebene Rekrutierungsmotiv von Rho dürfte von fundamentaler Bedeutung sein für die räumliche Aktivitätsregulation dieser Proteinfamilie in normalen und in stimulierten Zellen. / Shigella comprise enteroinvasive clones of E. coli and are the cause of bacillary dysentery in humans. Important virulence traits of these bacteria are encoded by the 220 kb pINV plasmid. The bloody-purulent diarrhea typically seen in this disease results from retrograde destruction of colonic mucosa after inital infection of the recto-sigmoid. Infection of intestinal mucosa is via M-cells and associated macrophages. After apoptotic degradation of macrophages the microorganism gains access to the basolateral pole of enterocytes. Direct infection of enterocytes from the intestinal lumen via the apical pole is not observed. Invasive shigella target the cytoplasm of enterocytes since relevant microbial replication only takes place in this compartment. Microbial spread within the epithelial cell layer is via protrusions of the cytoplasmic membrane that reach from cell to cell thus enabling intercellular transitions without leaving the safe cytoplasmic compartment of epithelial cells. Insight into the molecular mechanisms of epithelial cell invasion is therefore essential for the comprehension of the pathogenesis of the disease as well as the ecology of the microorganism. Infection of human epithelial cells by Shigella results from bacteria-induced formation of membraneous protrusions that finally fuse above the bacterium and morphologically resemble macropinocytosis. The formation of cellular protrusions is associated with important rearrangements of the cytoskeleton. In a micromorphological study we first described the different steps of cytoskeletal reorganization and the microarchitecture of the protrusions. We then could identify structure and regulatory molecules that are functionally involved in bacterial entry: T-plastin, Rho and a myosin IX. These studies also showed different bacteria-induced recruitment patterns of Rho isoforms and of various members of the Rho protein family. In particular, RhoA and RhoC were recruited into different regions of the invasion structure. Using exhaustive mutation analysis of these Rho isoforms, we for the first time characterized a human protein motif using methods of `cellular microbiology´. The recruitment motif described using our model of epithelial cell invasion by Shigella should be significant for the spatial regulation of activity of this protein family in normal and in stimulated cells.

This work addresses properties of two-component lipid membranes on the experimentally relevant spatial scales of order of a micrometer and time intervals of order of a second by means of lattice-based Monte Carlo (MC) simulations. To be able to do that with reasonable computational efforts the lipid membrane is modeled as a square lattice of lipid molecules with next-neighbor interaction. This allows for efficient computation and thus provides a large-scale simulation with which it was possible to obtain important results previously not reported in simulation studies of lipid membranes. After properly tuning the next-neighbor interaction energies the simulation reproduces the experimental phase diagram of the DMPC/DSPC lipid system which is used as a model system in this work. Beyond that, the MC simulation provides a more detailed description of the phase behavior of the lipid mixture than the experimental data. It is found that, within a certain range of lipid compositions, the phase transition from the fluid phase to the fluid–gel phase coexistence proceeds via near-critical fluctuations, while for other lipid compositions this phase transition has a quasi-abrupt character. The complete combined state and component phase diagram is constructed by structure function analysis which confirms the existence of a critical point in the system. The dynamics of membrane coarsening after an abrupt temperature quench to the fluid–gel coexistence region of the phase diagram are studied. In this context, it is found that lateral diffusion of lipids plays an important role in the fluid–gel phase separation process. Dynamic scaling is observed only if the ratio of gel and fluid phase in the membrane stays constant in time. The line tension characterizing lipid domains in the fluid–gel coexistence region is found to be in the pN range thus matching values both predicted theoretically and measured experimentally. When approaching the critical point, the line tension, the inverse correlation length of fluid–gel spatial fluctuations, and the corresponding inverse order parameter susceptibility of the membrane vanish in agreement with recent experimental findings for model lipid membranes. By simulating single particle tracking and fluorescence correlation spectroscopy experiments it is found that in the presence of near-critical fluctuations lipid molecules show transient subdiffusive behavior, which is a new result important for understanding the origins of subdiffusion in cell membranes which are believed to be close to a critical point. The membrane–cytoskeleton interaction strongly affects phase separation, enhances subdiffusion, and eventually leads to hop diffusion of lipids. Thus, a minimum realistic model for membrane rafts showing the features of both microscopic phase separation and subdiffusion is established.

This work addresses properties of two-component lipid membranes on the experimentally relevant spatial scales of order of a micrometer and time intervals of order of a second by means of lattice-based Monte Carlo (MC) simulations. To be able to do that with reasonable computational efforts the lipid membrane is modeled as a square lattice of lipid molecules with next-neighbor interaction. This allows for efficient computation and thus provides a large-scale simulation with which it was possible to obtain important results previously not reported in simulation studies of lipid membranes. After properly tuning the next-neighbor interaction energies the simulation reproduces the experimental phase diagram of the DMPC/DSPC lipid system which is used as a model system in this work. Beyond that, the MC simulation provides a more detailed description of the phase behavior of the lipid mixture than the experimental data. It is found that, within a certain range of lipid compositions, the phase transition from the fluid phase to the fluid–gel phase coexistence proceeds via near-critical fluctuations, while for other lipid compositions this phase transition has a quasi-abrupt character. The complete combined state and component phase diagram is constructed by structure function analysis which confirms the existence of a critical point in the system. The dynamics of membrane coarsening after an abrupt temperature quench to the fluid–gel coexistence region of the phase diagram are studied. In this context, it is found that lateral diffusion of lipids plays an important role in the fluid–gel phase separation process. Dynamic scaling is observed only if the ratio of gel and fluid phase in the membrane stays constant in time. The line tension characterizing lipid domains in the fluid–gel coexistence region is found to be in the pN range thus matching values both predicted theoretically and measured experimentally. When approaching the critical point, the line tension, the inverse correlation length of fluid–gel spatial fluctuations, and the corresponding inverse order parameter susceptibility of the membrane vanish in agreement with recent experimental findings for model lipid membranes. By simulating single particle tracking and fluorescence correlation spectroscopy experiments it is found that in the presence of near-critical fluctuations lipid molecules show transient subdiffusive behavior, which is a new result important for understanding the origins of subdiffusion in cell membranes which are believed to be close to a critical point. The membrane–cytoskeleton interaction strongly affects phase separation, enhances subdiffusion, and eventually leads to hop diffusion of lipids. Thus, a minimum realistic model for membrane rafts showing the features of both microscopic phase separation and subdiffusion is established.

The trafficking of insulin secretory granules(SGs) of pancreatic b-cells is a tightly controlled complex network. Increasing evidence indicates that the cortical actin cytoskeleton modulates the mobility and exocytosis of SGs,yet the mechanisms anchoring SGs to the cytoskeleton is not completely understood.It has been shown by Ort et al.(2000,2001) that the cytoplasmic tail of an intrinsic membrane protein of the SGs named ICA512/IA-2 binds the PDZ domain of b2-syntrophin,which in turn binds to the F-actin-binding protein utrophin. These data also indicate that stimulation of SG exocytosis affects the phosphorylation of b2-syntrophin,hence altering its binding to ICA512.Therefore a model was proposed whereby SGs are anchored to the actin cytoskeleton through the ICA512/b2-syntrophin complex, whose dynamics are regulated by phosphorylation.To test this model GFP-b2-syntrophin stable INS-1 cell clones were generated.GFP-b2-syntrophin expression and localization pattern were similar to those of the endogenous protein. Electron microscopy showed that in GFP-b2-syntrophin INS-1 cells the number of SGs with a pear-like shape was increased relative to control cells. Insulin content and stimulated secretion were increased in three GFP-â2-syntrophin INS-1 cell clones,compared to non-transfected INS-1 cells and INS-1 cells expressing GFP. These increments correlated with the different expression levels of GFP-b2-syntrophin in the three GFP-b2-syntrophin INS-1 cell clones. These findings support the hypothesis that b2-syntrophin regulates the trafficking and exocytosis of SGs by modulating their tethering to the actin cytoskeleton.In order to confirm the proposed model, the phosphorylation of b2-syntrophin was investigated in more detail. Similar to endogenous b2-syntrophin,GFP-b2-syntrophin underwent Ca2+-dependent and okadaic acid-sensitive dephosphorylation upon stimulation of insulin secretion. Stimulation-dependent dephosphorylation was confirmed by immunoprecipitation of 32P-labeled GFP-b2-syntrophin.Mass spectrometry of immunoprecipitated GFP-b2-syntrophin allowed the identification of four serine-phosphorylation sites (S75,S90,S213,S373) that could affect the binding to ICA512.Mutants,in which all four phosphoserines, were replaced by either asp or ala to mimic(S/D) or prevent(S/A) phosphorylation were expressed in INS-1 cells. All S/D mutants retained a cortical localization,but by immunoblotting the pattern of the S75D allele differed from wild type and all other S/D alleles.Conversely, all S/A alleles were diffused cytosolically, except S213A,which was still restricted to the cortex. Finally, pull down assays showed increased binding of ICA512 to the S75A and S90D alleles compared to wild type b2-syntrophin,while the opposite was observed with the S75D and S90A mutants.Additionally,both the S75 and the S213 allele conform a consensus for phosphorylation by Cdk5,which is known to modulate insulin secretion. The phosphorylation of GFP-b2-syntrophin and particularly the S75 allele by Cdk5 was exhibited with pharmacological inhibitors,by in vitro phosphorylation and by RNAi. Taken together, these findings are consistent with the model by which phosphorylation of b2-syntrophin modulates the tethering of SGs to the cytoskeleton, and thereby their mobility and exocytosis. Specifically, the data of this thesis suggest that Cdk5-dependent phosphorylation of the S75 site of GFP-b2-syntrophin facilitates insulin secretion by reducing the interaction of b2-syntrophin with ICA512,thereby decreasing the actin cytoskeleton constrain on SG mobility. This process could occur in combination with the phosphatase-dependent dephosphorylation of b2-syntrophin at phosphosites other than S75. / Der Transport Insulin-gefüllter sekretorische Granula(SG) ist ein streng kontrollierter komplexer Prozess.Es gibt vermehrt Beweise,dass das kortikale Actinzytoskelett die Ausschüttung der SGs beeinflusst.Bisher ist der Mechanismus der Verankerung von SGs am Zytoskelett noch nicht vollständig aufgeklärt.Ort et al.(2000,2001) haben gezeigt,daß der zytosoplasmatische Teil des trans-membranen SG-Proteins ICA512 mit der PDZ-Domäne von b2-Syntrophin interagiert.Dieses Protein bindet das F-Actin-Bindeprotein Utrophin.Die Ergebnisse zeigen außerdem,daß durch Stimulation der SG-Exozytose der Phosphorilierungsstatus von b2-Syntrophin beeinflusst wird,woraus ein verändertes Bindungsvermögen zu ICA512 resultiert.Es wurde ein Funktionsmodel vorgestellt,in dem sich SGs durch die Interaktion des ICA512/b2-Syntrophin Komplexes an das Actinzytoskelett binden.Dabei wird die Bindedynamik durch Phosphorilierung reguliert.Um dieses Model zu etablieren,wurden stabile GFP-b2-Syntrophin produzierende INS-1-Zellklone erzeugt.Die zelluläre Lokalisation und das Expressionsmuster von GFP-b2-Syntrophin stimmen mit dem des endogenen Proteins überein.Elektronenmikroskopie zeigte eine größe Anzahl oval-verformter SGs in GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.Verglichen mit nicht-transfizierten INS-1 Zellen waren in drei GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellklonen der Insulingehalt der Zellen und die stimulierte Insulinsekretion erhöht.Die Werte korrelierten mit den unterschiedlichen GFP-b2-Syntrophin Expressionsmengen der Klone.Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese,daß b2-Syntrophin den Transport und die Sekretion der SGs durch Modulation ihres Bindevermögens an Actin reguliert.Um das postulierte Model genauer zu prüfen,wurde die Phosphorilierung von b2-Syntrophin detaillierter untersucht.Das GFP-Protein wurde,ähnlich dem endogenen b2-Syntrophin,durch Stimulation der Insulinausschüttung dephosphoriliert.Diese Dephosphorilierung ist Ca2+-abhängig und Okadeinsäuresensitiv.Die stimulationsabhängige Dephosphorilierung wurde durch Immunoprezipitation von 32P-markiertem GFP-b2-Syntrophin bestätigt.Massenspektrometrie des präzipitierten Proteins ermöglichte die Identifikation von vier Serin-Phosphorilierungsstellen(S75,S90,S213,S373),welche die Bindung zu ICA512 beeinflussen könnten.Mutanten,in denen die vier Phosphoserine durch Asp beziehungsweise Ala ersetzt wurden,um entweder eine Phosphorilierung(S/D) oder Dephosphorilierung(S/A) nachzuahmen,wurden in INS-1-Zellen exprimiert.Alle S/D Mutanten blieben kortikal lokalisiert.Das Expressionsmuster des S75D Allels unterschied sich jedoch von denen des Wild-Typs(wt).Im Gegensatz dazu waren alle S/A Allele zytosolisch verteilt.Eine Ausnahme bildete S213A,das an der Zellkortex lokalisiert blieb.Im Vergleich zu wt b2-Syntrophin zeigten PullDown-Assays eine erhöhte Bindung von ICA512 zu den S75A und S90D Allelen.Das Gegenteil konnte für die S75D und S90A Mutanten nachgewiesen werden.S75,S90 und S213 sind in einer Konsensussequenz für Cdk5-Phosphorilierung enthalten.Diese Kinase kann die Insulinsekretion regulieren.Die Phosphorilierung von b2-Syntrophin,insbesondere des S75 Allels durch Cdk5 wurde durch pharmakologische Inhibitoren,in vitro-Phosphorilierung und RNAi demonstriert.Zusammenfassend stimmen diese Erkenntnisse mit dem Model überein,daß die Phosphorilierung von b2-Syntrophin die Vernetzung von SGs mit Actin und dadurch deren Mobilität und Exozytose moduliert.Im Speziellen postulieren die Ergebnisse dieser Arbeit eine Cdk5-abhängige Phosphorilierung der S75 Stelle des b2-Syntrophins.Durch eine verminderte Interaktion von b2-Syntrophin und ICA512 erleichtert diese Mutante vermutlich die Insulinsekretion,da der Einfluss des Actinzytoskeletts auf die Granulamobilität vermindert ist.Dieser Prozess ereignet sich möglicherweise in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.

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The trafficking of insulin secretory granules(SGs) of pancreatic b-cells is a tightly controlled complex network. Increasing evidence indicates that the cortical actin cytoskeleton modulates the mobility and exocytosis of SGs,yet the mechanisms anchoring SGs to the cytoskeleton is not completely understood.It has been shown by Ort et al.(2000,2001) that the cytoplasmic tail of an intrinsic membrane protein of the SGs named ICA512/IA-2 binds the PDZ domain of b2-syntrophin,which in turn binds to the F-actin-binding protein utrophin. These data also indicate that stimulation of SG exocytosis affects the phosphorylation of b2-syntrophin,hence altering its binding to ICA512.Therefore a model was proposed whereby SGs are anchored to the actin cytoskeleton through the ICA512/b2-syntrophin complex, whose dynamics are regulated by phosphorylation.To test this model GFP-b2-syntrophin stable INS-1 cell clones were generated.GFP-b2-syntrophin expression and localization pattern were similar to those of the endogenous protein. Electron microscopy showed that in GFP-b2-syntrophin INS-1 cells the number of SGs with a pear-like shape was increased relative to control cells. Insulin content and stimulated secretion were increased in three GFP-â2-syntrophin INS-1 cell clones,compared to non-transfected INS-1 cells and INS-1 cells expressing GFP. These increments correlated with the different expression levels of GFP-b2-syntrophin in the three GFP-b2-syntrophin INS-1 cell clones. These findings support the hypothesis that b2-syntrophin regulates the trafficking and exocytosis of SGs by modulating their tethering to the actin cytoskeleton.In order to confirm the proposed model, the phosphorylation of b2-syntrophin was investigated in more detail. Similar to endogenous b2-syntrophin,GFP-b2-syntrophin underwent Ca2+-dependent and okadaic acid-sensitive dephosphorylation upon stimulation of insulin secretion. Stimulation-dependent dephosphorylation was confirmed by immunoprecipitation of 32P-labeled GFP-b2-syntrophin.Mass spectrometry of immunoprecipitated GFP-b2-syntrophin allowed the identification of four serine-phosphorylation sites (S75,S90,S213,S373) that could affect the binding to ICA512.Mutants,in which all four phosphoserines, were replaced by either asp or ala to mimic(S/D) or prevent(S/A) phosphorylation were expressed in INS-1 cells. All S/D mutants retained a cortical localization,but by immunoblotting the pattern of the S75D allele differed from wild type and all other S/D alleles.Conversely, all S/A alleles were diffused cytosolically, except S213A,which was still restricted to the cortex. Finally, pull down assays showed increased binding of ICA512 to the S75A and S90D alleles compared to wild type b2-syntrophin,while the opposite was observed with the S75D and S90A mutants.Additionally,both the S75 and the S213 allele conform a consensus for phosphorylation by Cdk5,which is known to modulate insulin secretion. The phosphorylation of GFP-b2-syntrophin and particularly the S75 allele by Cdk5 was exhibited with pharmacological inhibitors,by in vitro phosphorylation and by RNAi. Taken together, these findings are consistent with the model by which phosphorylation of b2-syntrophin modulates the tethering of SGs to the cytoskeleton, and thereby their mobility and exocytosis. Specifically, the data of this thesis suggest that Cdk5-dependent phosphorylation of the S75 site of GFP-b2-syntrophin facilitates insulin secretion by reducing the interaction of b2-syntrophin with ICA512,thereby decreasing the actin cytoskeleton constrain on SG mobility. This process could occur in combination with the phosphatase-dependent dephosphorylation of b2-syntrophin at phosphosites other than S75. / Der Transport Insulin-gefüllter sekretorische Granula(SG) ist ein streng kontrollierter komplexer Prozess.Es gibt vermehrt Beweise,dass das kortikale Actinzytoskelett die Ausschüttung der SGs beeinflusst.Bisher ist der Mechanismus der Verankerung von SGs am Zytoskelett noch nicht vollständig aufgeklärt.Ort et al.(2000,2001) haben gezeigt,daß der zytosoplasmatische Teil des trans-membranen SG-Proteins ICA512 mit der PDZ-Domäne von b2-Syntrophin interagiert.Dieses Protein bindet das F-Actin-Bindeprotein Utrophin.Die Ergebnisse zeigen außerdem,daß durch Stimulation der SG-Exozytose der Phosphorilierungsstatus von b2-Syntrophin beeinflusst wird,woraus ein verändertes Bindungsvermögen zu ICA512 resultiert.Es wurde ein Funktionsmodel vorgestellt,in dem sich SGs durch die Interaktion des ICA512/b2-Syntrophin Komplexes an das Actinzytoskelett binden.Dabei wird die Bindedynamik durch Phosphorilierung reguliert.Um dieses Model zu etablieren,wurden stabile GFP-b2-Syntrophin produzierende INS-1-Zellklone erzeugt.Die zelluläre Lokalisation und das Expressionsmuster von GFP-b2-Syntrophin stimmen mit dem des endogenen Proteins überein.Elektronenmikroskopie zeigte eine größe Anzahl oval-verformter SGs in GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.Verglichen mit nicht-transfizierten INS-1 Zellen waren in drei GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellklonen der Insulingehalt der Zellen und die stimulierte Insulinsekretion erhöht.Die Werte korrelierten mit den unterschiedlichen GFP-b2-Syntrophin Expressionsmengen der Klone.Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese,daß b2-Syntrophin den Transport und die Sekretion der SGs durch Modulation ihres Bindevermögens an Actin reguliert.Um das postulierte Model genauer zu prüfen,wurde die Phosphorilierung von b2-Syntrophin detaillierter untersucht.Das GFP-Protein wurde,ähnlich dem endogenen b2-Syntrophin,durch Stimulation der Insulinausschüttung dephosphoriliert.Diese Dephosphorilierung ist Ca2+-abhängig und Okadeinsäuresensitiv.Die stimulationsabhängige Dephosphorilierung wurde durch Immunoprezipitation von 32P-markiertem GFP-b2-Syntrophin bestätigt.Massenspektrometrie des präzipitierten Proteins ermöglichte die Identifikation von vier Serin-Phosphorilierungsstellen(S75,S90,S213,S373),welche die Bindung zu ICA512 beeinflussen könnten.Mutanten,in denen die vier Phosphoserine durch Asp beziehungsweise Ala ersetzt wurden,um entweder eine Phosphorilierung(S/D) oder Dephosphorilierung(S/A) nachzuahmen,wurden in INS-1-Zellen exprimiert.Alle S/D Mutanten blieben kortikal lokalisiert.Das Expressionsmuster des S75D Allels unterschied sich jedoch von denen des Wild-Typs(wt).Im Gegensatz dazu waren alle S/A Allele zytosolisch verteilt.Eine Ausnahme bildete S213A,das an der Zellkortex lokalisiert blieb.Im Vergleich zu wt b2-Syntrophin zeigten PullDown-Assays eine erhöhte Bindung von ICA512 zu den S75A und S90D Allelen.Das Gegenteil konnte für die S75D und S90A Mutanten nachgewiesen werden.S75,S90 und S213 sind in einer Konsensussequenz für Cdk5-Phosphorilierung enthalten.Diese Kinase kann die Insulinsekretion regulieren.Die Phosphorilierung von b2-Syntrophin,insbesondere des S75 Allels durch Cdk5 wurde durch pharmakologische Inhibitoren,in vitro-Phosphorilierung und RNAi demonstriert.Zusammenfassend stimmen diese Erkenntnisse mit dem Model überein,daß die Phosphorilierung von b2-Syntrophin die Vernetzung von SGs mit Actin und dadurch deren Mobilität und Exozytose moduliert.Im Speziellen postulieren die Ergebnisse dieser Arbeit eine Cdk5-abhängige Phosphorilierung der S75 Stelle des b2-Syntrophins.Durch eine verminderte Interaktion von b2-Syntrophin und ICA512 erleichtert diese Mutante vermutlich die Insulinsekretion,da der Einfluss des Actinzytoskeletts auf die Granulamobilität vermindert ist.Dieser Prozess ereignet sich möglicherweise in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.