O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis e questões ambientais têm gerado grandes preocupações para a sociedade, e alternativas sustentáveis e eficientes para solucionar e trazer inovações na produção de biocombustíveis estão cada vez mais próximas. O uso de biomassa pode ser uma vantajosa opção, mas para isso, é necessária a degradação das moléculas constituintes de sua parede celular a açúcares fermentáveis. A biotecnologia tem melhorado e aumentado as opções para suprir fontes sustentáveis e preservação do meio ambiente. A transformação de biomassa na escala industrial para produção de bioetanol depende da capacidade de otimizar o processo de hidrólise enzimática da celulose utilizando enzimas de complexo celulolítico, principalmente de fontes bacterianas e fungos filamentosos. Dessa forma, estudamos a principal endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913, que foi inicialmente identificada através de zimogramas e espectrometria de massas que mostrou boa cobertura de sequência e purificada utilizando passos de precipitação com sulfato de amônio seguida do uso de uma coluna de exclusão molecular. Esta enzima teve seus parâmetros cinéticos determinados, mostrando-se ativa para diversos substratos testados e também grande estabilidade para variações de pH e temperatura, com condições ótimas de pHótimo = 7.0 e Tótima = 45°C. Além da caracterização enzimática, a posição relativa entre o domínio catalítico e de ligação da celulose (CBM) da Endoglucanase por SAXS também foram determinadas, e ainda, para finalizar os estudos estruturais, a estrutura cristalográfica do domínio catalítico da enzima foi determinada com resolução de 2.8Å, contendo quatro moléculas por unidade assimétrica. / The exhaustion of fossil fuels and the environment issues related have been generated many concerns for the society and searching for sustainable and effective alternative are being done in order to solve and bring innovations for biofuel production. Biomass can be a good alternative, but, for the success, it will be necessary degrading the cellular wall molecules into fermentable sugar. Biotechnology has improved and increased options in order to supply sustainable sources and environment preservation. The biomass transformation for bioethanol production, at the industrial scale, depends on the capacity of optimize the enzymatic hydrolysis of cellulose using enzymes of the cellulolytic complex, mainly produced by bacteria and filamentous fungi. We have studied the main endoglucanase of Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913 which has been initially identified by zymograms and mass spectrometry with high coverage sequence, and purified using precipitation with ammonium sulfate followed by size exclusion column. This enzyme had its kinetic parameters determined showing activity for the substrates tested and also has showed stability for pH and temperature changes, with optimal conditions of pHopt = 7.0 and Topt = 45°C. Following this enzymatic characterization, the relative position of the catalytic domain and cellulose binding domain (CBM) was determined by SAXS. In order to complete the structural studies, the crystallographic structure of the catalytic domain has been determined with 2.8Å of resolution, showing four molecules by asymmetric unity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20092011-101408 |
| Date | 20 July 2011 |
| Creators | Rosseto, Flávio Rodolfo |
| Contributors | Polikarpov, Igor |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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