Le travail décrit dans ce manuscrit porte sur la recherche de nouvelles activités enzymatiques nitrilases et plus particulierement α-aminonitrilases. Le but de ce travail était, dans un premier temps, de tester un grand nombre de nitrilases candidates sur un large panel de nitriles pour appréhender leurs activités et établir un catalogue de nouvelles activités nitrilases. Dans un second temps, la recherche de nouvelles activités α-aminonitrilase a été menée dans l’objectif de réaliser la synthèse d’α-aminoacides par dédoublement cinétique dynamique assistée par couplage avec une racemase. 163 protéines ont été sélectionnées par une approche génomique, et testées sous forme de lysat cellulaire à l’aide d’un test enzymatique couplé à la glutamate deshydrogénase sur 28 nitriles répartis en 7 familles (α-aminonitriles exclus). Le grand nombre de résultats positifs obtenus à l’issu du criblage nous a permis d’évaluer les activités nitrilases et d’établir un catalogue de ces activités et d’envisager l’utilisation de certaines de ces nouvelles nitrilases dans la synthèse de synthons chimiques. Après sélection de 38 nitrilases et vérification de leurs activités sur enzymes purifiées, 8 nitrilases ont été testées sur 5 nouveaux nitriles déclinés du 3-phénylpropanenitrile. Une synthèse énantiospécifique de β-ester acide précurseur possible de quinolines fonctionnalisées a été réalisée. La déclinaison des dinitriles a également été abordée, 12 nitrilases sélectionnées ont été testées sur 6 dinitriles. Une nouvelle nitrilase nous a permis de réaliser la désymétrisation de l’iminodiacétonitrile par monohydrolyse. Enfin, de nouvelles activités nitrilases ont été observées sur des cyclooxonitriles pour la formation de plateformes chirales fonctionnalisées. Selon une autre approche génomique, 425 nitrilases candidates ont été selectionnées et testées (en plus les 163 nitrilases du précédent criblage) sous forme de lysat cellulaire grâce à la mise au point d’un suivi de l’activité nitrilase par dérivatisation et analyse par LC-MS sur 6 α-aminonitriles précurseurs d’α-aminoacides naturels. Le criblage a permis de mettre en évidence de nouvelles activités α-aminonitrilases sur le phénylglycinonitrile et le 2-amino pentanenitrile. De nouveaux nitriles déclinés du phénylglycinonitrile, précurseurs d’α-aminoacides d’interêt pharmacologique, ont été téstés sur 4 α-aminonitrilases. / The work described in this manuscript deals with on the search of new nitrilase activities especially α-aminonitrilases. In a first step, the aim was to build a catalog of nitrilase activities. In a second step, the search of new α-aminonitrilase activities was carried out for the synthesis of α-aminoacids by dynamic kinetic resolution with a racemase. Following a genomic approach, 163 proteins were selected and screened as cell lysate. The nitrilase activity was monitored by coupled enzymatic assay with glutamate dehydrogenase on 25 nitriles representative of the structural diversity. The large majority of proteins showed to be promiscuous towards the substrates. The best activities were validated using purified enzymes. Applications to the biocatalyzed synthesis of two building blocks, enantiomerically enriched acid (R)-4-methoxy-4oxo-3-phenylbutanoic acid and (S)-3-oxocyclopentanecarboxylic and the desymmetrization of iminodiacetonitrile by monohydrolyse, were performed. Through selection by a broader genomic approach, 588 candidates nitrilases were then tested on six α-aminonitriles. Analytical monitoring providing access to both conversion and enantiospecificity was developed by LC-MS. Six proteins were found to be active towards two substrates allowing applications to the synthesis of phenylglycine analogs with pharmacological properties.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012EVRY0033 |
| Date | 14 December 2012 |
| Creators | Bordier, Franck |
| Contributors | Evry-Val d'Essonne, Zaparucha, Anne |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage, InteractiveResource |
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