La neurofibromatose de type 1 (NF1) constitue la maladie autosomique dominante la plus fréquente avec une incidence d’environ 1 naissance pour 3500. Les manifestations cliniques les plus courantes sont neurocutanées et se caractérisent par une hyperpigmentation générale diffuse avec une impression de peau brune, des tâches hyperpigmentées dites tâches café-au-lait, des tumeurs bénignes de la gaine des nerfs périphériques appelées neurofibromes et des troubles neurologiques. Le gène NF1, responsable de la maladie est un gène suppresseur de tumeur qui code pour la neurofibromine. Les mécanismes moléculaires associés à l’altération de la pigmentation chez ces patients restent jusqu’ici inconnus. Nous avons étudié cette question grâce à la mise en place au laboratoire d’un protocole de différenciation des cellules souches pluripotentes en mélanocytes et l’accès à deux lignées de cellules souches embryonnaires porteuses de la mutation causale de NF1 (hESC-NF1). Dans cette étude, nous avons montré qu’une perte d’expression de la neurofibromine dans les mélanocytes dérivés de hESC-NF1 reproduisait le phénotype d’hyperpigmentation généralisée et pouvait mimer la formation des tâches « café au lait ». L’analyse des mécanismes moléculaires associés à ce phénotype pathologique montre que les mélanocytes NF1 présentent une dérégulation des voies de signalisation AMPc et ERK conduisant à l’augmentation de la mélanogenèse. Le phénotype hyperpigmentaire des mélanocytes NF1 a pu être corrigé grâce à l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques spécifiques de la voie AMPc, de la voie ERK et de la mélanogenèse. En parallèle, afin de pouvoir envisager une approche de thérapie cellulaire à partir des mélanocytes dérivés de cellules pluripotentes pour le traitement de maladies associées à une hypopigmentation d’origine génétiques ou non, un protocole de différenciation fondé sur une application séquentielle de cytokines permettant de diriger de manière spécifique les cellules souches pluripotentes en mélanocytes a été développé au laboratoire. Des mélanocytes fonctionnels ont été obtenus en 30 jours en engagement la différenciation des cellules souches vers la crête neurale afin d’induire l’émergence de précurseurs de mélanocytes par l’action de molécules telles que la BMP4, l’acide ascorbique, l’endotheline 3, le SCF et un activateur de WNT3a (CHIR99021L’ensemble de ce travail a permis de valider la pertinence de l’utilisation des cellules souches pluripotentes porteuses de maladie génétique ou pour le traitement de maladies hyper ou hypopigmentaire par des approches de modélisation pathologique et de criblage pharmacologique ou par des approches de thérapie cellulaire. / Neurofibromatosis type 1 is one of the most common autosomal dominant diseases (1/3500). Café-au-lait” macules (CALMs); overall skin hyperpigmentation, neurofibromas (benign tumors resulting from Schwann cell proliferation) and deficits cognitive are the mains clinical manifestations. NF1 is caused by mutations in a tumor suppressor gene that encodes neurofibromin, a functional RAS-GTPase-activating protein (RAS-GAP). Neurofibromin down-regulates RAS signaling by accelerating the conversion of active RAS-GTP to inactive RAS-GDP. The resulting decreased expression of neurofibromin leads to activation of several important downstream signaling pathways, including MEK/MAPK, AKT/mTOR and cAMP-mediated protein kinase A pathways. In order to better understand molecular mechanisms linking neurofibromin and associated manifestations in the pathology, mouse models have been established. However, these models don’t reproduce systematically cutaneous manifestations associated with NF1. To overcome this issue, we take advantage that pluripotent stem cells possess the capacity of self-renew and are able to differentiate into a wide variety of cell types. A growing number of examples illustrate how such cells, retrieved from genetically selected donors carrying the causal mutation of a monogenic disorder, may reproduce disease-associated phenotypes. Two human embryonic stem cell lines derived from embryos characterized as mutant-gene carriers for NF1 during a pre-implantation diagnosis procedure were differentiated into a pure and proliferative melanocytes, in order to explore mechanisms associated with hyperpigmentation and “café-au-lait” macules associated with NF1. In this study, we demonstrated that NF1 melanocytes reproduce the hyperpigmentation phenotype in vitro, and further characterized the link between loss of heterozygosity and the typical “café au lait” macules that appear over the general hyperpigmentation. Molecular mechanisms associated with these pathological phenotypes correlate with an increased activity of cyclic AMP-mediated protein kinase A and ERK1/2 signaling pathways, leading to increase of melanogenesis. Finally, the hyperpigmentation phenotype could be rescued by using specific inhibitors of these signaling pathways. In parallel, to consider a cell therapy approach from melanocytes derived from pluripotent cells for the treatment of hypopigmentation disorders related to the death or dysfunction of melanocytes such as Griscelli or Vitiligo syndromes, a differentiation protocol based on sequential application of molecules to specifically induce the differentiation of pluripotent stem cells into melanocytes was developed in the laboratory. Functional melanocytes were obtained in 30 days by the commitment of pluripotent stem cells into melanocytes precursors via neural crest state by the action of molecules such as BMP4, ascorbic acid, endothelin 3, SCF and an activator of Wnt3a (CHIR99021). All of this work has validated the appropriateness of the use of pluripotent stem cells carring genetic mutations or not to treat hyper or hypopigmentation disease by identified pharmoclogical treatment or by a cell therapy approach.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015EVRY0015 |
| Date | 02 July 2015 |
| Creators | Allouche, Jennifer |
| Contributors | Evry-Val d'Essonne, Baldeschi, Christine |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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