Um problema recorrente no desenvolvimento de vacinas de DNA e terapia gênica utilizando vetores não virais é a baixa eficiência de transfecção gênica. Isso ocorre devido às diversas barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que o DNA precisa superar para chegar ao núcleo das células. Neste trabalho tem-se por objetivo o desenvolvimento de novos vetores não virais de entrega gênica, formados por DNA plasmidial (pDNA), proteínas (protamina ou T-Rp3) e nanopartículas de ouro (NPAu) na forma de complexos ternários. Para tal, NPAu\'s foram sintetizadas por redução com citrato de sódio, apresentando diâmetros entre 20,3 e 57,3 nm e potencial zeta entre -69,0 e +43,3 mV, dependendo das condições de síntese, a saber, das quantidades de citrato de sódio adicionadas e da ordem de adição dos reagentes. Em seguida, vetores compostos por pDNA-protamina/T-Rp3-NPAu foram formados, transfectados em células HeLa cultivadas in vitro, e a atividade da enzima repórter luciferase foi medida. Deste modo, a partir de variações em proporção mássica e tamanho de nanopartículas, foi possível obter complexos utilizando protamina e ouro com uma eficiência de transfecção 33 vezes melhor do que transfecções utilizando apenas protamina. Por outro lado, complexos contendo T-Rp3 e ouro se mostraram ainda mais eficazes na entrega, apresentando níveis de transfecção próximos ao do reagente comercial Lipofectamina. Ensaios de transfecção utilizando a droga nocodazol indicaram a importância dos microtúbulos no mecanismo de entrega gênica, e ensaios com a droga cloroquina evidenciaram que as nanopartículas de ouro atuam de maneira diferenciada no escape endossomal dos vetores não virais utilizados. Visando relacionar características físico-químicas com a eficiência de transfecção, alguns destes complexos foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz, em que complexos com protamina apresentaram tamanhos entre 116 e 363 nm e complexos com T-Rp3 apresentaram entre 135 e 307 nm e potenciais zeta entre +7,3 e +22,5 mV e +10,6 e +27,2 mV, respectivamente, dependendo das características das NPAu\'s. / A recurrent problem in the development of DNA vaccines and gene therapy using non-viral vectors is the low efficiency of transfection. That is due to the many physical, enzymatic and diffusional barriers that DNA must overcome to reach the cell nucleus. This work aims to develop novel non-viral vectors based on plasmid DNA (pDNA), proteins (protamine or recombinant T-Rp3) and gold nanoparticles (AuNP) as ternary complexes. For such, AuNP\'s were first synthesized via sodium citrate reduction, with diameters varying from 20,3 to 57,3 nm and zeta potentials between -69,0 and +43,3 mV, depending on synthesis conditions, changing the quantities of sodium citrate added and the order of addition of reagents. Vectors formed by pDNA-protamine/T-Rp3-AuNP were then formed, transfected and luciferase activity was measured. Thus, from variations on mass ratios and gold nanoparticle sizes, it was possible to obtain complexes with protamine and gold with a transfection efficiency 33 times higher than analog complexes using only protamine. Also, complexes containing T-Rp3 and gold showed an even higher delivery efficiency, with transfection efficiency close to Lipofectamine. Assays using nocodazole indicated the importance of microtubule in the gene delivery process and, whereas assays with chloroquine showed that gold nanoparticles act in a different way over endossomal escape of used non-viral vectors. Finally, some of these complexes were characterized with dynamic light scattering. Complexes with protamine were within the size ragne of 116 to 363 nm and complexes with T-Rp3 were within the size range of 135 to 307 nm. The zeta potential varied from +7,3 to +22,5 mV and from +10,6 to +27,2 mV, respectively, depending on the gold nanoparticles used.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-25102017-075918 |
| Date | 08 May 2017 |
| Creators | Palma, Matheus Mlot |
| Contributors | Azzoni, Adriano Rodrigues |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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