Bei Tumoren von Kopf und Hals kann primär oder adjuvant durch Bestrahlung therapiert werden. Die Folgen dieser Behandlung können Xerostomie, Karies, Infektionen, Dysphagie oder Mundgeruch sein. Diese Nebenwirkungen vermindern die Lebensqualität des Patienten. Unterschiedliche Behandlungsansätze haben aufgrund von therapiebedingten Einschränkungen nicht den Weg in den klinischen Alltag gefunden. Eine Alternative zu den vorhandenen Behandlungsansätzen kann das Tissue Engineering sein. Das Ziel einer Normalisierung der Speichelproduktion nach Behandlung soll durch eine implantierbare, künstliche Speicheldrüse erreicht werden. Kann humanes natives Speicheldrüsengewebe der Parotis auf gradientenfreiem dreidimensional aufgebauten Polyurethan wachsen und seine Funktionalität beibehalten?
Humane Parotiszellen wurden von 20 Patienten im Alter von 42 - 90 Jahren durch Operation entnommenen und in Polystyrol-Zellkulturflaschen mit dem Nährmedium BEGM herangezüchtet. Es erfolgte eine 2D-Zellverteilung der reinen Parotiskultur. Zur Kontrolle der Vitalität zwischen den Passagen wurde eine Trypan-Blau Färbung verwendet. Als Trägermaterial der Zellen wurde eine biokompatible, abbaubare Matrix aus ε-Polycaprolacton verarbeitet. Die Übertragung der humanen Parotiszellen wurde mit einer Kleberproteinlösung, bestehend aus den Hauptbestandteilen Aprotinin, Fibrinogen und der Thrombinlösung durchgeführt. 7,14 und 21 Tage nach Aufbringung wurde der Überstand der zeitgleich entnommenen Konstrukte zur Überprüfung des α-Amylase konserviert. Zusätzlich wurden an den 3 Untersuchungstagen Konstrukte für die Anfertigung von histologischen Schnitten, quantitativer PCR, indirekter Immunfluoreszenz und zur Elektronenmikroskopie entnommen. Zur Überprüfung der Funktionalität der angezüchteten Speicheldrüsenzellen wurde das Enzym α-Amylase und das Wasserkanalprotein Aquaporin 5 herangezogen.
Bei der Kultivierung der humanen Speicheldrüsenzellen konnte durch den Vitalitätstest Trypan-Blau Färbung in Kombination mit einer Neubauerzählkammer eine konstant hohe Anzahl an vitalen Zellen bis zur 4. Passage nachgewiesen werden. Durch die Lebend/Tot Färbung auf FDA/EB Basis der Konstrukte über die Untersuchungszeit von 14 Tagen konnte keine Vermehrung von avitalen Zellen mikroskopisch festgestellt werden. Die statistische Auswertung mittels Boxplots des ELISA berechnete für den ersten Untersuchungstag einen Median auf niedrigem Niveau von 4,4 U/l und sank im weiteren Zeitverlauf am Untersuchungstag 21 auf die niedrigsten Median von 2,2 U/l ab. α-Amylase konnte an allen 3 Tagen mittels quantitativer PCR und indirekter Immunfluoreszenz belegt werden. Aquaporin 5 als Funktionsnachweis war in der vorliegenden Studie nicht signifikant durch quantitative PCR beweisbar. Die Rasterelektronenmikroskopie bildete adhärente Zellen in kugeliger Form aus den besiedelten Matrices nach 7 Tagen Kultivierung ab. Durch die Transmissionselektronenmikroskopie konnten Zellen, die Zellfortsätze ausgebildet hatten nach 14 Tagen beobachtet werden. Der Versuch, histologische Schnitte auf Grundlage der Paraffineinbettung oder Kryo-Konservierung zu erzeugen, musste frustran abgeschlossen werden.
Eine Kultivierung von Speicheldrüsenzellen auf einer Matrix aus ε-Polycaprolacton ohne Gradienten ist eingeschränkt umsetzbar. Die Studie konnte zeigen, dass das Wachstum der Zellen auf konstant niedrigem Niveau über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen lag. Der Funktionsnachweis von α-Amylase auf absinkendem niedrigem Niveau sowie fehlender Bestätigung von Aquaporin 5 kann als stationäre Phase des Wachstums interpretiert werden. Zur Verbesserung der Zellentwicklung sollte die besiedelte Matrix zu einem 3D-Zellwachstum anregen. Bei sequenziell entstehender Polarität der Zellen käme es zu einer Verbesserung der Vitalität sowie der vermehrten Ausbildung von α-Amylase und Aquaporin 5. Dies könnte in einer Kombination der Zellkultur aus Parotiszellen mit Kokulturen aus humanen Myoepithelzellen und Parenchymzellen erreicht werden. Sehr gute Ergebnisse des Zellwachstums und der Zellfunktion konnten aktuell in anderen Studien auf der Trägersubstanz Matrigel oder durch Rebesiedelung von dezellularisierten Organen beobachtet werden. / In the case of tumours of the head and neck, the tumour can be treated primarily or adjuvantly by radiation. The consequences of this treatment can be xerostomia, caries, infections, dysphagia or bad breath. These side effects reduce the patient's quality of life. Different treatment approaches have not found their way into the clinical routine due to therapy related limitations. Tissue engineering can be an alternative to the existing treatment approaches. The goal of normalising saliva production after treatment is to be achieved by means of an implantable, artificial salivary gland. Can human native salivary gland tissue of the parotid gland grow on gradient-free three-dimensional polyurethane and retain its functionality?
Human parotid gland cells were taken from 20 patients aged 42 - 90 years by surgery and cultivated in polystyrene cell culture bottles with the culture medium BEGM. A 2D cell distribution of the pure parotid culture was performed. A trypan-blue staining was used to control the vitality between the passages. A biocompatible, degradable matrix of ε-polycaprolactone was used as carrier material for the cells. The transfer of human parotid cells was performed with a glue protein solution consisting of the main components aprotinin, fibrinogen and the thrombin solution. 7, 14 and 21 days after application, the supernatant of the constructs taken at the same time was preserved for the examination of α amylase. In addition, constructs for the preparation of histological sections, quantitative PCR, indirect immunofluorescence and electron microscopy were taken during the 3 days of examination. The enzyme α-amylase and the water channel protein aquaporin 5 were added to test the functionality of the cultivated salivary gland cells.
During the cultivation of human salivary gland cells, the vitality test Trypan blue staining in combination with a Neubauer counting chamber showed a constantly high number of vital cells up to the 4th passage. The live/dead staining on FDA/EB basis of the constructs over the examination period of 14 days did not show any proliferation of avital cells. The statistical evaluation by means of ELISA box plots calculated a median at a low level of 4.4 U/l for the first day of the examination and dropped to the lowest median of 2.2 U/l on examination day 21. α-amylase was detected on all 3 days by quantitative PCR and indirect immunofluorescence. Aquaporin 5 as a functional test was not significantly detectable by quantitative PCR in this study. The scanning electron microscopy imaged adherent cells in spherical form from the colonised matrices after 7 days of cultivation. Using transmission electron microscopy, cells that had formed cell extensions could be observed after 14 days. The attempt to produce histological sections based on paraffin embedding or cryopreservation had to be frustrated.
Cultivation of salivary gland cells on a matrix of ε-polycaprolactone without gradients is of limited use. The study was able to show that the growth of the cells was at a constantly low level over the 21-day period of the study. The proof of function of α-amylase at a decreasing low level and the lack of confirmation of aquaporin 5 can be interpreted as a stationary phase of growth. To improve cell development, the colonised matrix should stimulate 3D cell growth. If the cells were to develop a sequential polarity, there would be an improvement in vitality as well as increased formation of α-amylase and aquaporin 5. This could be achieved by a combination of cell culture from parotid cells with cocultures of human myoepithelial cells and parenchymal cells. Very good results of cell growth and cell function could be observed in other studies on the carrier substance Matrigel or by re-colonisation of decellularised organs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:21688 |
| Date | January 2020 |
| Creators | Ströhle, Serge - Peer |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.003 seconds