Η κυτταροφαγία βακτηρίων από τα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα του αίματος του ανθρώπου επιτυγχάνεται με την ενεργοποίηση διαφόρων σηματοδοτικών μονοπατιών. Η σηματοδότηση ξεκινάει με την προσκόλληση των βακτηρίων στην πλασματική μεμβράνη των κυττάρων και καταλήγει στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, στο σημείο επαφής, για τη δημιουργία του φαγοσώματος. Διάφορες μορφές δραστικού οξυγόνου, όπως το Η2Ο2, παράγονται παρουσία βακτηρίων, και δρουν ως σηματοδοτικά μόρια.
Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η παραγωγή και η συμμετοχή του Η2Ο2 στην κυτταροφαγία E.coli από τα ανθρώπινα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το εξειδικευμένο φθορίζον μόριο, διυδροροδαμίνη (DHR) - που οξειδώνεται από το Η2Ο2 - καθώς και φθορίζοντα βακτήρια E. coli. Πειράματα κυτταρομετρίας ροής έδειξαν ότι τα πολυμορφοπύρηνα παράγουν Η2Ο2 παρουσία E. coli, ενώ παράλληλα δείχτηκε με έμμεσο τρόπο, με ανοσοαποτύπωση, η μετατόπιση της κυτταροπλασματικής υπομονάδας p47 για την συγκρότηση μεμβρανικής NADPH οξειδάσης. Το ένζυμο αυτό παράγει υπεροξεικά ιόντα τα οποία μετατρέπονται, στη συνέχεια, σε Η2Ο2 από τη δεσμουτάση SOD. Ο ενεργός ρόλος του Η2Ο2 στη ρύθμιση της κυτταροφαγίας, επιβεβαιώθηκε με τη χρήση εξειδικευμένων αναστολέων για τα ένζυμα της σύνθεσής του, N-εθυλμαλειμίδιο (N-ethylmaleimide - nem) για τη NADPH οξειδάση και διεθυλδιθειοκαρβαμικό (diethyldithiocarbamate – ddc) για την δεσμουτάση του υπεροξεικού ανιόντος. Οι αναστολείς αυτοί μείωσαν και την παραγωγή του Η2Ο2 και την κυτταροφαγία βακτηρίων σε καλλιέργεια λευκών αιμοσφαιρίων. Ανοσοαποτυπώματα για τις ΜΑΡ κινάσες, p38 και ΕΡΚ1/2, από εκχύλισμα λευκών αιμοσφαιρίων, μετά από καλλιέργεια παρουσία των παραπάνω αναστολέων, έδειξαν ότι κατά την κυτταροφαγία E. coli, μόνο η φωσφορυλίωση της ERK1/2 μειώνεται όταν μειώνεται η παραγωγή Η2Ο2.
Είναι γνωστό ότι το Η2Ο2 απενεργοποιεί φωσφατάσες πρωτεϊνικών τυροσινών (PTPs). Από τα αποτελέσματα μπορεί να υποτεθεί ότι το Η2Ο2 που παράγεται κατά την κυτταροφαγία, απενεργοποιεί τις PTPs, ενισχύοντας τη δράση κινασών τη φωσφορυλίωση της ERK1/2 και να ολοκληρωθεί η διαδικασία της κυτταροφαγίας. Αναστολή της παραγωγής του Η2Ο2 αυξάνει τη δράση των PTPs, την αποφωσφορυλίωση της pERK1/2 και τελικά να μειώνει την κυταροφαγία. / Phagocytosis by human polymorphonuclear blood cells, is achieved by the activation of several signaling pathways. Signaling is initiated with the attachment of the bacteria on the plasma membrane of the cells and is completed with the remodeling of actin on that sight leading to the formation of the phagosome. Certain reactive oxygen species, such as Η2Ο2, which are produced in the presence of bacteria, have been referred to act as signaling molecules.
In the present work, we investigated the production and participation of Η2Ο2 in the phagocytosis of E. coli by the human polymorphonuclear cells. For this purpose specific fluorescent probe dihydrorhodamine (DHR) - which is oxidised by H2O2 - and fluorescent E. coli were used. Flow cytometry analysis revealed the production of Η2Ο2 by polymorphonuclears, during phagocytosis of E. coli, while in parallel, it was indirectly shown with immunoblotting, the translocation of cytoplasmic p47 subunit for the assembly of the membrane NADPH oxidase. This enzyme produces superoxide ions which are then converted in H2O2 by superoxide dismutase (SOD). The active role of Η2Ο2, in the regulation of phagocytosis, was confirmed with the use of specific enzyme inhibitors of its synthesis, N-ethylmaleimide (nem) for the NADPH oxidase and diethyldithiocarbamate (ddc) for superoxide dismutase. These inhibitors decreased E. coli phagocytosis in polymorphonuclear cells cultures along with the decrease of Η2Ο2 production. Immunoblot analysis of ΜΑΡ kinases p38 and ERK1/2, from crude extracts of cultured white blood cells, in the presence of the above inhibitors, showed that the phosphorylation of ERK1/2 was reduced when H2O2 was blocked. On the other hand, p38 phosphorylation was not influenced at all.
It is known that the target molecules of Η2Ο2 are a family of protein tyrosin phosphatases (PTPs) which are getting inactivate. From the above data, it may be assumed that Η2Ο2, which is produced by the polymorphonuclear blood cells, during phagocytosis, inactivates these enzymes, in order to promote the activity of kinases enhancing the phosphorylation of ERK1/2, among others, so that phagocytosis to be completed. Thus, when the H2O2 production is inhibited, the activity of the PTPs increases, leading to the dephosphorylation of pERK1/2 and the observed decrease of bacterial uptake.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/5642 |
| Date | 24 October 2012 |
| Creators | Καραμολέγκου, Γεωργία |
| Contributors | Κατσώρης, Παναγιώτης, Karamolegkou, Georgia, Κατσώρης, Παναγιώτης, Δημητριάδης, Γεώργιος, Ροσμαράκη, Ελευθερία |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
Page generated in 0.0029 seconds