Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια
των πενταμερών ιοντικών καναλιών (LGICs), που περιλαμβάνει τους υποδοχείς
σεροτονίνης (5-HT3), γλυκίνης (GlyR) και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA, GABAB).
Κάθε υπομονάδα του nAChR αποτελείται από μία αμινο-τελική εξωκυτταρική περιοχή
(ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας, από
τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Οι nAChRs
διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρικούς.
Οι μυϊκοί nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων Torpedo sp. και στις
νευρομυϊκές συνάψεις σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μείς.
Σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ στα
ενήλικα άτομα θηλαστικών, με δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των
α1-ΕΚΠ και της γ(ε) και δ-ΕΚΠ. Στην α1-ΕΚΠ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος
περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται αντι-nAChR αντισώματα στην περίπτωση
της βαριάς μυασθένειας. Οι νευρικοί nAChRs βρίσκονται στο κεντρικό και περιφερικό
νευρικό σύστημα, όπου διαβιβάζουν τις νευρικές ώσεις. Σχηματίζουν είτε ετεροπενταμερή,
μεταξύ 2-3 α-υπομονάδων (υπότυποι α2-6) και 2-3 β-υπομονάδων (υπότυποι β2-4), ή
ομοπενταμερή. Η α7 είναι η μόνη γνωστή υπομονάδα του νευρικού nAChR που σχηματίζει
ομοπενταμερή μόρια στον άνθρωπο, με πέντε θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών
υποκαταστατών.
Μέχρι στιγμής, έχουν πραγματοποιηθεί τέσσερα σημαντικά επιτεύγματα, όσον αφορά
την κατανόηση της δομής των nAChRs: Α. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία
ακτίνων-Χ, της ομόλογης προς τα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nAChR (25%
αμινοξική ταύτιση με την α7), ομοπενταμερούς πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh
γαστεροπόδων (AChBP), καθώς και των δομών της με διάφορους χολινεργικούς
προσδέτες. Προσεγγίστηκε έτσι για πρώτη φορά η διαμόρφωση των nAChR-θέσεων
πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Β. Η λύση της δομής, με ηλεκτρονική
μικροσκοπία, του Torpedo nAChR, η οποία αποκάλυψε την δευτεροταγή και τριτοταγή
δομή του nAChR. Εντούτοις, λόγω της περιορισμένης ευκρίνειας (4 Å), δεν αποκάλυψε τη
συγκρότηση των θέσεων πρόσδεσης της ACh σε ατομικό επίπεδο. Γ. Η λύση της δομής σε
υψηλή ευκρίνεια (1,94 Å) του συμπλόκου της α1-ΕΚΠ επίμυος με τον nAChR-
ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx). Η λυση αυτής της δομής αποκάλυψε σε ατομικό
επίπεδο την MIR περιοχή, τις θηλιές Α, B και C της κυρίως πλευράς των θέσεων
πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών και τη χαρακτηριστική Cys θηλιά. Δεδομένου όμως,
ότι η δομή της α1-ΕΚΠ αναπαριστά ένα μονομερές, η δομή μίας πλήρως διαμορφωμένης
θέσης πρόσδεσης εξακολουθεί να απουσιάζει. Δ. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία
ακτίνων-Χ, μίας προκαρυωτικής LGIC πρωτεΐνης (ELIC), η οποία θεωρείται μάλιστα πως
αποτελεί τον πρόγονο όλων των ευκαρυωτικών LGICs, συμπεριλαμαβανομένου του
nAChR, με την οποία αποκαλύφθηκε ο βασικός σκελετός της δομής των LGICs. Είναι
φανερό, ότι παρόλα αυτά τα επιτεύγματα, απουσιάζει ακόμη η λύση της δομής ενός
πενταμερούς nAChR. Η νευρική α7 υπομονάδα του nAChR είναι μία καλή υποψήφια για
την επίτευξη αυτού του στόχου, αφού σχηματίζει πενταμερή in vivo. Επιπλέον, αυτή
εμπλέκεται σε ένα μεγάλο αριθμό νευρικών παθήσεων (Alzheimer, Parkinson, επιληψία,
σχιζοφρένεια, κλπ), και η λύση της δομής της θα οδηγήσει και στο σχεδιασμό
θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι αυτών των ασθενειών. Μάλιστα, εφ’όσον στην α7-
ΕΚΠ εδράζουν οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, είναι πιο ρεαλιστική η
προσπάθεια κρυστάλλωσης αυτής της περιοχής αντί ολόκληρου του α7 nAChR, αφού οι
εκτενείς υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές του τελευταίου περιορίζουν τη διαλυτότητά
του.
Στο παρελθόν είχαμε εκφράσει στο Εργαστήριό μας την ανθρώπινη α7-EKΠ αγρίου
τύπου και ένα διπλό μετάλλαγμα αυτής, σε κύτταρα P. pastoris, με στόχο μελέτη της δομής
τους. Τα μόρια αγρίου τύπου, βρέθηκαν όμως να είναι αρκετά υδρόφοβα, αφού
εκφράσθηκαν ως συσσωματώματα πολύ υψηλού μοριακού βάρους (ΜΒ) και ως ολιγομερή
μεγαλύτερα από πενταμερή. Τα μόρια του διπλού μεταλλάγματος, στα οποία ολόκληρη η
Cys θηλιά του α7 nAChR αντικαταστάθηκε από την πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της AChBP
σε συνδυασμό με την μετάλλαξη Cys116Ser, εμφάνισαν μεν αυξημένη διαλυτότητα και
ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, διατήρησαν όμως δε ένα σημαντικό βαθμό δημιουργίας
συσσωματωμάτων υψηλού ΜΒ, οδηγώντας σε αποτυχείς προσπάθειες κρυστάλλωσής τους.
Στην παρούσα μελέτη, στηριχθήκαμε στο τρισδιάστατο μοντέλο της ανθρώπινης α7-
ΕΚΠ, το οποίο κατασκευάσαμε χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία τις, μόνες γνωστές έως τότε,
δομές της AChBP και της α-EKΠ του Torpedo nAChR, προκειμένου να σχεδιάσουμε νέες
μεταλλάξεις για την ενίσχυση της διαλυτότητας και της πενταμερούς συγκρότησης των α7-
ΕΚΠ μορίων. Έτσι, μεταλλάξαμε τα εκτεινόμενα, στο εξωτερικό περιβάλλον του μοντέλου,
υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα προς λιγότερο υδρόφοβα, με στόχο την αύξηση της
διαλυτότητας των εκφραζόμενων α7-ΕΚΠ μορίων, καθώς και μερικά κατάλοιπα της
διεπιφάνειας μεταξύ γειτονικών α7-ΕΚΠ πρωτομερών προς μεγαλύτερα ή φορτισμένα, με
στόχο την εισαγωγή επιπλέον υδρογονικών ή ηλεκτροστατικών δεσμών με αντικρυστά
κατάλοιπα της γειτονικής α7-ΕΚΠ υπομονάδας. Η μελέτη των χρωματογραφημάτων
μοριακής διήθησης και δυναμικής σκέδασης του φωτός όλων των προκύπτοντων α7-ΕΚΠ
μεταλλαγμάτων υπέδειξε ότι αυτά που έφεραν μεταλλάξεις σε κατάλοιπα της διεπιφάνειας
εκφράσθηκαν όπως τα μόρια αγρίου-τύπου, ενώ αυτά που έφεραν την αντικατάσταση των
εκτειθέμενων υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων από λιγότερο υδρόφοβα, εμφάνισαν
σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου. Μάλιστα, ένα
τουλάχιστον τέτοιο μετάλλαγμα (mut-10), εμφάνισε σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα και
ως προς το προϋπάρχον διπλό μετάλλαγμα, αφού εκφράσθηκε αποκλειστικά υπό τη μορφή
ολιγομερών με κοντινό στο θεωρητικά αναμενόμενο ΜΒ για πενταμερή μόρια. Επιπλέον,
εμφάνισε μία σημαντικά αυξημένη συγγένεια πρόσδεσης για τον σημασμένο ανταγωνιστή
125I-α-bgtx (Kd = 24 nM), σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου (Kd = 70 nM) και διπλού
μεταλλάγματος (Kd = 52 nM), η οποία πρόσδεση βρέθηκε να αναστέλλεται από μη
σημασμένα μόρια α-bgtx, d-τουμποκουραρίνης ή νικοτίνης (Ki = 21,5 nM, Ki = 127 μM, Ki
= 17,5 mM, αντίστοιχα). Οι τιμές αυτές των σταθερών για το mut-10 είναι χαμηλότερες
από αυτές των μορίων αγρίου τύπου και άλλων μεταλλαγμάτων, ενώ είναι αρκετά κοντινές
προς αυτές του φυσικού μορίου α7 nAChR, υποδηλώνοντας ταυτόχρονα την αύξηση στην
ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, αλλά και την κοντινή διαμόρφωση
του mut-10 στο χώρο με αυτό των φυσικών μορίων. Επιπρόσθετα, μελέτες κυκλικού
διχρωϊσμού, αποκάλυψαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα mut-10
μόρια, καθώς και τοπικές αλλαγές στη διαμόρφωσή τους κατά την πρόσδεση διάφορων
χολινεργικών προσδετών. Επίσης, αποκάλυψαν τη σύσταση της δευτεροταγούς δομής των
ανθρώπινων α7-ΕΚΠ μορίων, η οποία βρέθηκε να είναι ~45% β-πτυχωτή επιφάνεια και 5%
α-έλικα, σε συμφωνία με αυτή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR, της
AChBP και της α1-EKΠ του nAChR επίμυος. Τέλος, με ηλεκτρονική μικροσκοπία
αποκαλύφθηκε ένας υψηλός βαθμός ομοιογένειας των εκφραζόμενων mut-10 μορίων, και η
συγκρότησή τους πιθανότατα σε πενταμερή με εμφανή το χαρακτηριστικό κεντρικό πόρο, ο
οποίος αποτελεί την απαρχή του ιοντικού καναλιού σε ολόκληρο τον α7 nAChR.
Συμπερασματικά, το μετάλλαγμα mut-10 της παρούσης μελέτης είναι κατάλληλο για
δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, απαραίτητες για την έναρξη ενός ορθολογικού
σχεδιασμού φαρμάκων έναντι των ασθενειών που συνδέονται με τον α7 nAChR. Επιπλέον,
δεδομένου ότι τα απογλυκοζυλιωμένα mut-10 μόρια διατήρησαν την υδροφιλικότητα, την
ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών και τη δευτεροταγή τους δομή, αυτά
είναι επίσης κατάλληλα για κρυσταλλώσεις, αφού μάλιστα σε αυτή την περίπτωση
αυξάνεται πιθανότατα και ο βαθμός ομοιογένειάς τους.
Ένας παράλληλος σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η ανίχνευση με μελέτες
κυκλικού διχρωϊσμού, της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των α1-, β1-, γ- και ε-
ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR, τα οποία είχαν επίσης εκφρασθεί σε κύτταρα
P. pastoris. Οι μελέτες αυτές αποκάλυψαν ότι το κυρίαρχο δευτεροταγές δομικό
χαρακτηριστικό όλων αυτών των μορίων ήταν η β-πτυχωτή επιφάνεια (~40%), ενώ
παρατηρήθηκε και μία μικρή συμμετοχή α-έλικας (~5%), σε συμφωνία με την δευτεροταγή
δομή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR και της AChBP και με τη
μεταγενέστερη των αποτελεσμάτων αυτών, λύση της δομής της α1-ΕΚΠ του nAChR
επίμυος. Επίσης, επιβεβαίωσαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα μόρια
αυτά, κάτι που είχε στο παρελθόν υπαινιγχθεί από βιοχημικές και ανοσοχημικές μελέτες.
Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν την κοντινή προς τα φυσικά μόρια διαμόρφωση των
ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR που εκφράζονται στο Εργαστήριό μας, και
ενισχύουν τη χρήση τους για περαιτέρω δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, αλλά και ως
ειδικούς ανοσοπροσροφητές των αντι-nAChR αντισωμάτων ορών μυασθενικών σε μία, υπό
ανάπτυξη από το Εργαστήριό μας, αντιγονο-ειδική θεραπευτική προσέγγιση της βαριάς
μυασθένειας. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) belong to the superfamily of pentameric
ligand-gated ion channels (LGICs), also including serotonin (5-HT3), glycine and γ-
aminobutyric acid receptors (GABAA and GABAC). Each nAChR subunit consists of an Nterminal
extracellular domain (ECD), harbouring the signature Cys-loop, four
transmembrane α-helices and a small cytoplasmic loop. nAChRs are classified into muscle
and neuronal types.
Muscle-type nAChRs are found in fish electric organs and at the vertebrate
neuromuscular junctions, where they mediate neuromuscular transmission. They form
heteropentamers with a stoichiometry (α1)2β1γδ or (α1)2β1εδ in adult mammalian nAChR
and bear two ligand-binding sites formed between α1- and γ(ε)- or δ-ECDs. The α1-ECD
hosts the main immunogenic region (MIR), against which a large number of anti-nAChR
antibodies are directed in the autoimmune disease, myasthenia gravis. Neuronal nAChRs
are widely distributed in the central and peripheral nervous system and play key roles in
neuron-neuron interactions. They exist either as heteropentamers of 2-3 α subunits
(subtypes α2–6) plus 2-3 β subunits (β2–4) or as homopentamers. α7 is the only human
neuronal subunit known to form a homopentamer with five ligand-binding sites between its
ECDs.
Regarding the atomic structure of nAChR, four major breakthroughs have been
achieved so far: A. The X-ray crystal structure of the homologous to nAChR α-ECDs (25%
sequence identity with α7), molluscan homopentameric acetylcholine-binding protein
(AChBP) and its complexes with various cholinergic ligands, which approached the
structure of the nAChR ligand-binding site in atomic detail for the first time. Β. Τhe 4Å
electron microscopy (EM) structure of the Torpedo nAChR, which revealed the architecture
of the muscle-type nAChR-ECDs and the fivefold symmetry of the receptor. Nevertheless,
given the relatively low-resolution, no atomic details for the ligand-binding site could be
observed. C. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex of mouse muscle
α1-ECD with the nAChR antagonist α-bungarotoxin (α-bgtx), which revealed atomic details
for the MIR epitope, the loops A, B and C, forming the principal side of the nAChR ligandbinding
pocket and the Cys-loop. However, since the structure of mouse α1-ECD is a
monomer, the nAChR ligand-binding site is still missing. D. The high-resolution X-ray
crystal structure of a prokaryotic LGIC (ELIC protein) considered to be the ancestor of
eukaryotic LGICS, including the nAChR, which revealed the core structure of the LGICs.
Apparently, it still remains essential to obtain the structure of a pentameric nAChR-ECD in
high-resolution, so as to look deep into the details of the complete nAChR ligand-binding
pockets. Neuronal α7 nAChR is a good candidate for achieving this goal, as it forms
homopentamers. Furthermore, since α7 nAChR is implicated in neurological diseases and
disorders (Alzheimer’s, Parkinson’s, epilepsy, schizophrenia, etc), elucidation of its
structure will also lead to the rational drug-design towards these diseases. Furthermore,
since the α7-ECD is of the main pharmacological interest as this bears the ligand-binding
sites, it seems more realistic to perform crystallization trials on this domain, rather than on
the intact α7 nAChR, due to the large hydrophobic transmembrane domains of the latter.
Our laboratory has previously expressed the wild-type and a double mutant of human
α7-ECD in yeast P. pastoris, with the aim to proceed to their detailed structural analysis.
However, the wild-type was expressed in the form of microaggregates and oligomers larger
than the expected pentamers, whereas the double mutant, carrying the mutation Cys116Ser
and the replacement of its Cys-loop by the more hydrophilic AChBP Cys-loop, appeared to
be more soluble than the wild-type and capable of binding α-bgtx with an increased affinity,
relatively close to that of the native α7 nAChR. However, this mutant was still aggregationprone
to some extent, thus leading to unsuccessful crystallization trials.
Therefore, in the present study, we based on the model of human α7-ECD constructed
using as templates the X-ray crystal structure of L-AChBP and the electron microscopy
structure of the Torpedo nAChR α1-ECD, and introduced several mutations in α7-ECD so
as to enhance both its solubility and assembly to pentamers. The hydrophobic amino acid
residues found exposed to the environment of α7-ECD model were mutated to less
hydrophobic ones, with the aim to reduce the considerably high hydrophobicity of α7-ECD
molecules, while various residues facing the interface between two adjacent α7-ECD
protomers were mutated to larger or charged residues, with the aim to introduce additional
hydrogen or electrostatic bonds with facing residues of the adjacent protomer.
Gel filtration and dynamic light scattering analysis for the novel α7-ECD mutants under
study, suggested that the mutants carrying mutations in the interface-located amino acid
residues were expressed similarly to the wild-type, whereas the mutants carrying the
substitution of external hydrophobic residues by less hydrophobic ones, all appeared
significantly more water-soluble than the wild-type molecules. Moreover, at least one
mutant (mut-10) presented enhanced solubility compared to both the wild type and the
previously studied soluble double mutant, as it was expressed exclusively to oligomers
close to a pentameric form. Furthermore, it displayed a significantly improved binding
affinity for the nAChR antagonist 125I-α-bgtx (Kd = 24 nM), compared to the wild type (Kd
= 70 nM) and to the double mutant (Kd = 52 nM), the binding being inhibited by unlabelled
α-bungarotoxin, d-tubocurarine or nicotine (Ki = 21.5 nM, Ki = 127 μM, Ki = 17.5 mM,
respectively). These values for mut-10 are comparable to those for the native α7 nAChR,
denoting its native-like conformation. Circular dichroism (CD) studies on mut-10 suggested
a well-defined tertiary structure and special local conformational changes upon binding of
several cholinergic ligands. They also revealed a secondary structure composition (~5% α-
helix, ~45% β-sheet) similar to that of the homologous Torpedo nAChR-ΕCDs, AChBP and
mouse muscle α1-nAChR-ECD. Finally, electron microscopy studies revealed a high degree
of homogeneity and well-assembled particles of the expressed mut-10, probably
pentameric, with the characteristic formation of the central hole, which in the case of the
intact α7 nAChR continues to the central pore.
In conclusion, the mutagenesis strategy followed in the current study, towards a
crystallisable α7-ECD form, led to the construction and expression of at least one novel mutant
(mut-10), which is a promising starting material for atomic-resolution studies, essential for
rational drug design towards diseases related to the α7-nAChR. Furthermore, since its
deglycosylated form maintained its solubility, ligand-binding properties and secondary
structure, it is even more appropriate for crystallization, as it appears to be more
homogeneous than the glycosylated molecules.
Another aim of the present study was to probe the structure of the α1-, β1-, γ- and ε-
ECDs of the human muscle nAChR, previously expressed in yeast P. pastoris, by
performing CD studies. These studies demonstrated that the dominant structural feature of
all these ECDs is β-sheet structure (~40%) with a small contribution of α-helical content
(~5%). This was the first time direct experimental evidence appeared for the secondary
structure composition of human nAChR-ECDs, which seems to be in very good agreement
with that of the similar Torpedo muscle-type nAChR-ECDs and in considerable, though
lower, agreement with that of the less homologous AChBPs. The subsequent structure
solution of the α1-ECD of the mouse muscle nAChR in high resolution, further confirmed
the native-like conformation of the human muscle nAChR-ECDs expressed in our
laboratory, since their secondary structure composition was also in considerable agreement
with that of mouse α1-ECD (47% β-sheet; 7% α-helix). The CD studies also suggested
well-defined tertiary structures and considerable folding for all human muscle nAChR-ECDs under study, as this was previously implied by biochemical and immunochemical
studies. In conclusion, these results strongly suggest that the ECDs of the human muscle
nAChR under study fold to a near-native conformation, confirming their suitability for
more detailed structural studies and for their use as specific immunoadsorbents in an under
development antigen-specific therapeutic strategy to remove pathogenic anti-nAChR
antibodies from myasthenic patients’ sera.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/1766 |
| Date | 19 August 2009 |
| Creators | Ζουριδάκης, Μάριος |
| Contributors | Τζάρτος, Σωκράτης, Zouridakis, Marios, Τζάρτος, Σωκράτης, Σπυρούλιας, Γεώργιος, Πουλάς, Κωνσταντίνος, Συνετός, Διονύσιος, Ηλιόπουλος, Ηλίας, Παπαπετρόπουλος, Ανδρέας, Πατρινός, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0039 seconds