Στα πλαίσια αυτής της διδακτορικής εργασίας μελετήθηκαν οι εμπορικά σημαντικότερες περιοχές καλλιέργειας και συγκομιδής οστρακοειδών του Ελλαδικού χώρου.
Κατά τη διάρκεια περιόδου 18 μηνών πραγματοποιήθηκε μηνιαία συλλογή δειγμάτων στρειδιών (Οstrea edulis) και μυδιών (Mytilus galloprovincialis), τα οποία συλλέχθηκαν από έξι (6) διαφορετικά σημεία του Ελλαδικού χώρου και αναλύθηκαν για τους εντεροϊούς (EV), τους αδενοϊούς (Adv), τον ιό της ηπατίτιδας Α (HAV), τους ιούς Noro I και II (NLVI και NLVII), για το βακτήριο Ε. coli, καθώς και για σωματικούς κολιφάγους, τους F-sperific RNA βακτηριοφάγους και τους βακτηριοφάγους του Β. fragilis. Επιπλέον αναπτύχθηκαν μέθοδοι τόσο για την ανίχνευση παθογόνων ιών ανθρώπινης προέλευσης στα οστρακοειδή, όσο και για την ανίχνευση των "πιθανών δεικτών" αυτών των ιών. Οι μέθοδοι εξετάστηκαν προκειμένου να αξιολογηθεί η απόδοση καλής ποιότητας από όλα τα εργαστήρια μέσω διεργαστηριακών αναλύσεων.
Η μέθοδος που εφαρμόστηκε σε αυτή τη μελέτη για την ανίχνευση των ιών στα οστρακοειδή βασίζεται στην εξαγωγή και την ομογενοποίηση του πεπτικού αδένα με χρήση διαλύματος γλυκίνης, pH 10, απομόνωση των νουκλεϊνικών οξέων και ενίσχυση του γονιδιώματος των ιών που αναλύονται.
Για την ανίχνευση του βακτηρίου E. coli χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των πολλαπλών σωλήνων, ενώ για την ανίχνευση των βακτηριοφάγων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος καλλιέργειας διπλοστιβάδας.
Για το βακτήριο E. coli, σε σύνολο 138 δειγμάτων, 110 δείγματα (ποσοστό 79,7%) βρέθηκαν να ανήκουν στην κατηγορία Α (MPN/100g σάρκας = <20 έως 220), δηλαδή χαρακτηρίζονται σαν δείγματα χαμηλής μόλυνσης, 25 δείγματα (ποσοστό 18,1%) βρέθηκαν να ανήκουν στην κατηγορία Β (MPN/100g σάρκας = 220 έως 3500), οπότε χαρακτηρίζονται σαν δείγματα μεσαίας μόλυνσης, ακατάλληλα προς κατανάλωση χωρίς να προηγηθεί διαδικασία εξυγίανσης, ενώ μόνο 3 δείγματα (ποσοστό 2,2%) βρέθηκαν να ανήκουν στη κατηγορία C (MPN/100g σάρκας =3500 έως >18000), δηλαδή είναι δείγματα υψηλής μόλυνσης.
Οι ιοί που εμφανίζονται με μεγαλύτερη συχνότητα στα οστρακοειδή της Ανατολικής Μεσογείου είναι οι αδενοϊοί (34% των δειγμάτων βρέθηκαν θετικά για τους αδενοϊούς) και ακολουθούν οι εντεροϊοί (16,7% των δειγμάτων βρέθηκαν θετικά για τους εντεροϊούς). Αντίθετα, ο ιός της ηπατίτιδας Α (ποσοστό θετικών δειγμάτων = 4,34%), καθώς και οι ιοί Noro I (ποσοστό θετικών δειγμάτων = 2,1%) και Noro II (ποσοστό θετικών δειγμάτων = 1,47%%) εμφανίζονται σε μικρό ποσοστό δειγμάτων.
Τέλος, 80 δείγματα (58%) βρέθηκαν θετικά (παρουσία πλακών βακτηριοφάγων) για τους σωματικούς κολιφάγους, με τον αριθμό των πλακών να κυμαίνεται από 71,4 έως 584800 pfp/100g, 52 δείγματα (37,7%) βρέθηκαν θετικά για τους F-specific RNA βακτηριοφάγους (αριθμός των πλακών από 76,2 έως 17051 p100g) και 33 δείγματα (24%) βρέθηκαν θετικά για τους βακτηριοφάγους του Bacteroides fragilis (αριθμός των πλακών από 194.5 έως 5266,25 pfp/100g).
Τόσο για το βακτήριο E. coli όσο και για τους βακτηριοφάγους πραγματοποιήθηκαν διεργαστηριακές αναλύσεις προτύπων, οι οποίες οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι οι αντίστοιχες μέθοδοι χαρακτηρίζονται ως αξιόπιστες.
Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι το βακτήριο E. coli παρουσιάζει θετική συσχέτιση με τους σωματικούς κολιφάγους, αλλά δεν δείχνει στατιστικά σημαντική συσχέτιση ούτε με τους F-specific RNA βακτηριοφάγους, ούτε με κανέναν από τους ιούς εντερικής προέλευσης. Επίσης, θετική συσχέτιση παρουσίασαν οι αδενοϊοί με τους εντεροϊούς, καθώς και οι σωματικοί κολιφάγοι με τους βακτηριοφάγους του B. fragilis.
Η μοναδική συσχέτιση μεταξύ ιών εντερικής προέλευσης και βακτηριοφάγων βρέθηκε για τους αδενοϊούς και τους βακτηριοφάγους του B. fragilis. Εάν αυτό επιβεβαιωθεί σε περαιτέρω μελέτες, τότε η συγκεκριμένη κατηγορία βακτηριοφάγων θα μπορούσε να αποτελέσει έναν καλό δείκτη πρόβλεψης της παρουσίας αδενοϊών σε δείγματα οστρακοειδών.
Επιπλέον μελετήθηκε η σχέση που μπορεί να υπάρχει μεταξύ των φυσικοχημικών παραμέτρων και των μικροοργανισμών που εξετάστηκαν. Η επεξεργασία αυτή οδήγησε στο συμπέρασμα ότι το βακτήριο E. coli ανιχνεύεται σε μεγαλύτερα ποσά όταν το διαλυμένο οξυγόνο και η περιεκτικότητα σε άλας του ύδατος είναι αυξημένα. Αντίθετα, αύξηση της θερμοκρασίας οδηγεί σε μείωση της ανίχνευσης του βακτηρίου. Επίσης, η περιεκτικότητα σε άλας φαίνεται να επηρεάζει θετικά και τον ιό της ηπατίτιδας Α, αν και ο μικρός αριθμός θετικών δειγμάτων γι’αυτόν τον ιό δεν μπορεί να επιτρέψει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Το pH και το διαλυμένο οξυγόνο των υδάτων οδηγεί σε αύξηση της ανίχνευσης των βακτηριοφάγων του B. fragilis, χωρίς όμως να μπορούμε να ισχυριστούμε ότι κάτι τέτοιο ισχύει, λόγω του μικρού αριθμού θετικών δειγμάτων γι’αυτούς τους βακτηριοφάγους. Τέλος, η αύξηση της θερμοκρασίας των υδάτων φαίνεται να οδηγεί και σε αύξηση της παρουσίας των F-specific RNA βακτηριοφάγων, και το ίδιο παρατηρήθηκε και με την αύξηση του διαλυμένου οξυγόνου στο νερό.
Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη διεξοδική έρευνα για την ιογενή κοπρανώδη μόλυνση τον οστρακοειδών στην Ελλάδα. Επιπλέον, αντιπροσωπεύει την πρώτη μελέτη σχετικά με τη αποτελεσματικότητα των οργανισμών - δεικτών ιϊκής μόλυνσης, καθώς και για τη συσχέτιση της μικροβιολογικής επιβάρυνσης των οστρακοειδών με τις φυσικοχημικές παραμέτρους του περιβάλλοντος ύδατος. Η μελέτη κατάλληλων δεικτών που σχετίζονται με την παρουσία εντερικών ιών στα οστρακοειδή οδήγησε σε χρήσιμα συμπεράσματα για τη χρήση της ανίχνευσης των βακτηριοφάγων ως δεικτών ιϊκής μόλυνσης. Εντούτοις, απαιτείται περαιτέρω μελέτη προκειμένου να προσδιοριστεί και η χρήση των βακτηριοφάγων ως δεικτών που θα μαρτυρούν την προέλευση (ανθρώπινη ή ζωική) των εντερικών ιών που ανιχνεύονται στα οστρακοειδή. / In this doctorate investigation, important shellfish growing areas of Greece have been defined and studied.
Oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) were obtained on a monthly basis over an 18 month sampling period. These samples were collected by six (6) different points of Greece and were analyzed for enteroviruses (EV), adenoviruses (Adv), virus of hepatitis A (HAV), Noro viruses I and II (NLVI and NLVII ), bacterium E. coli, as well as for somatic coliphages, F-sperific RNA bacteriophages and bacteriophages of B. fragilis. Moreover, methods were developed for the detection of pathogenic viruses of human origin in the shellfish, as well as for the detection of potential "viral indicators". The methods were examined in order to validate the good quality performance from all the laboratories via interlaboratory analyses.
The method that used in this study for the detection of human enteric viruses in the shellfish is based on the export and homogenisation of digestive gland with glycine buffer at pH 10, viral nucleic acid extraction and amplification of the genomes of the analysed human viruses.
The procedure applied for detection of E. coli consists on a five tube, three dilution most probable number (MPN) method, while the method for the detection of bacteriophages was the double-agar-layer method.
For E. coli analysis, in a total number of 138 samples, 110 samples (79,7%) were found to belong in category A (MPN / 100 g of flesh = < 20 until 220), that it means these samples are characterized as samples of low pollution, 25 samples (18,1%) were found to belong in category B (MPN / 100 g of flesh = 220 until 3500), therefore are characterized as samples of intermediate pollution, inadequate to consumption without precedes process of cleansing, while only 3 samples (2,2%) were found to belong in category C (MPN / 100 g of flesh = 3500 until > 18000), that it means they are samples of high pollution.
The viruses that are presented with higher frequency in the shellfish of Eastern Mediterranean are the adenoviruses (34% of samples were found positive for adenoviruses) and follow enteroviruses (16,7% samples they were found positive for enteroviruses). On the contrary, virus of hepatitis A (percentage of positive samples = 4,34%), as well as the Noro I viruses (percentage of positive samples = 2,1%) and Noro II viruses (percentage of positive samples = 1,47%%) are presented in small number of samples.
Finally, 80 samples (58%) were found positive (presence of plaques of bacteriophages) for somatic coliphages, with the number of plaques between 71,4 and 584800 pfp / 100 g, 52 samples (37,7%) were found positive for F - specific RNA bacteriophages (number of plaques from 76,2 to 17051 pfp/ 100 g) and 33 samples (24 %) were found positive for the bacteriophages of B. fragilis (number of plaques from 194,5 to 5266,25 pfp / 100 g).
Interlaboratory studies involved the testing of reference materials of E. coli and bacteriophages were used as part of the good quality performance assessment program to be applied all over the study, and led to the conclusion that the corresponding methods are characterized by good reliability.
According to the statistical analysis of the results, the presence of E. coli seems to be significantly related with the presence of somatic coliphages. However, E. coli do not present significant statistical relation neither with F - specific RNA bacteriophages, nor with all of the viruses of intestinal origin. Also, adenoviruses were significantly related with enteroviruses, as well as somatic coliphages with the bacteriophages of B. fragilis.
The unique significant relation between viruses of intestinal origin and bacteriophages was found for the adenoviruses and bacteriophages of B. fragilis. If this is confirmed in further studies, then this category of bacteriophages could constitute a good indicator of forecast of presence adenoviruses in samples of shellfish.
Moreover, we studied the relation that can exist between the physic-chemical parameters and the micro-organisms that were examined. This analysis led to the conclusion that E. coli is detected in higher levels when the dissolved oxygen and the salinity of water are increased. On the contrary, increase of temperature leads to reduction of detection of E. coli. Also, the salinity appears to influence positively also virus of hepatitis A, even if the small number of positive samples of this virus cannot allow the export of sure conclusions. The pH and the dissolved oxygen of waters lead to increase of detection of bacteriophages of B. fragilis, but the small number of positive samples for these bacteriophages can’t give safe conclusions. Finally, the increase of temperature of waters appears to lead also to increase of presence of F - specific RNA of bacteriophages, and the same was also observed with the increase of dissolved oxygen in water.
This study constitutes the first extensive research for the fecal viral pollution of shellfish in Greece. Moreover, it represents the first study with regard to the effectiveness viral indicators, as well as for the correlation of microbiological parameters of shellfish with the physical-chemical parameters of water. The study of suitable indicators that are related with the presence of enteric viruses in the shellfish led to useful conclusions on the use of detection of bacteriophages as indicators of viral pollution. Nevertheless, further study is required in order to determine also the use of bacteriophages as indicators that will testify the origin (human or animal) of the enteric viruses that are detected in the shellfish.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/832 |
| Date | 01 August 2008 |
| Creators | Τσιμπουξή, Ανδρομάχη |
| Contributors | Παπαπετροπούλου, Μαρία, Σπηλιοπούλου-Σδούγκου, Ίριδα, Ηλιοπούλου-Γεωργουδάκη, Ιωάννα, Καλπαξής, Δημήτριος, Αναστασίου, Ευάγγελος, Βανταράκης, Απόστολος, Γελαστοπούλου, Ελένη, Παληογιάννη, Φωτεινή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0037 seconds