Η ανάπτυξη πρωτεϊνικών κρυστάλλων, κατάλληλων για κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, είναι γνωστό ότι είναι το βασικό στοιχείο του προσδιορισμού της πρωτεϊνικής δομής. Οι κρυσταλλογράφοι αντιμετωπίζουν σε καθημερινή βάση προβλήματα όπως η ποσότητα της πρωτεΐνης, η διαθεσιμότητα της υψηλής ποιότητας κρυστάλλων πρωτεΐνης και ο έλεγχος του μεγέθους του κρυστάλλου. Πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για να βελτιωθεί η διαδικασία κρυστάλλωσης με τη χρήση των μαγνητικών πεδίων, της ηλεκτρό-εστίασης, και των εσωτερικών ή εξωτερικών ηλεκτρικών πεδίων. Τα ηλεκτρικά πεδία αποτελούν μια σημαντική μεθοδολογική πρόοδο και έχουν χρησιμοποιηθεί προκειμένου να ενισχυθεί η δημιουργία και ανάπτυξη πυρήνων κρυστάλλωσης.
Σε αυτή την εργασία διερευνήθηκε η επίδραση της ασύρματης μεταγωγής ρεύματος κατά την κρυστάλλωση της λυσοζύμης, της ριβονουκλεάσης Α και της ινσουλίνης χρησιμοποιώντας μια πρωτότυπη συσκευή παραγωγής ιόντων. Η μέθοδος διάχυσης ατμών χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις πειραματικές διατάξεις. Η ποιότητα των κρυστάλλων και η τρισδιάστατη δομή των πρωτεϊνών που καλλιεργήθηκαν με και χωρίς την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου αναλύθηκαν μέσω της περίθλασης ακτίνων-Χ.
Οι κρύσταλλοι εμφανίστηκαν νωρίτερα στα δείγματα που εκτέθηκαν στο ηλεκτρικό πεδίο σε σχέση με τα μη εκτεθειμένα δείγματα κάτω από ταυτόσημες συνθήκες. Επιπλέον, οι κρύσταλλοι πρωτεΐνης που ελήφθησαν σε μικρότερους χρόνους ήταν μεγαλύτεροι σε μέγεθος. Αρκετά ενδιαφέρον ήταν ότι η ποιότητα των κρυστάλλων που αναπτύχθηκαν στις εκτεθειμένες σταγόνες ήταν η ίδια, αν όχι καλύτερη από, εκείνη των κρυστάλλων που αναπτύχθηκαν στις μη εκτεθειμένες σταγόνες σε κάποιο ηλεκτρικό πεδίο.
Η διαδικασία πυρήνωσης φαίνεται να διαφέρει μετά από την έκθεση σε κάποιο ηλεκτρικό πεδίο από ότι η μη έκθεση σε αυτό υπό ταυτόσημες συνθήκες. Η χρήση της πρωτότυπης συσκευής ασύρματης μεταγωγής ρεύματος φαίνεται να επάγει τον προσανατολισμό των πολικών μορίων της πρωτεΐνης, ευνοώντας έτσι την κρυστάλλωση. Η χρήση της συσκευής προσφέρει το πλεονέκτημα ότι παρέχει φορτισμένα σωματίδια πάνω σε ολόκληρη την εκτεθειμένη επιφάνεια του διαλύματος κρυστάλλωσης, ενώ ταυτόχρονα ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο μόλυνσης. Επίσης, η συσκευή αυτή είναι πολύ απλούστερη και ευκολότερη στη χρήση από ό,τι άλλες συσκευές με κλασικά ηλεκτρόδια. / The growth of protein crystals, suitable for X-ray crystallography is known to be the basic element of the protein structure determination. Crystallographers face problems such as the amount of the protein, the availability of high-quality protein crystals and the control of the crystal size in a daily basis. Many efforts have been made to improve crystallization process with the use of magnetic fields, electro–focusing, and internal or external electric fields. The electric fields consist a significant methodological advancement and have been used in order to enhance nucleation and crystal growth.
In this work, the influence of a non-contact current transfer upon the crystallization of Lysozyme, Rnase A and Insulin was investigated using a prototype ion-generator device. The vapor diffusion method was used in both hanging and sitting drop setups. The crystal quality and the three-dimensional structure of lysozyme grown with and without the EF influence were analyzed by means of X-ray diffraction.
Crystals appeared earlier in samples exposed to NCCT than in non-exposed samples under identical conditions. Furthermore, protein crystals that were obtained after shorter times were larger in size when grown after exposure to NCCT device. More interestingly, the quality of the crystals grown in NCCT-exposed drops was the same as, if not better than, that of the crystals grown in the control drops.
The nucleation process after exposure to NCCT differs from that after exposure to an ion-free gas stream under identical conditions. The use of the NCCT prototype device appears to induce the orientation of the polar protein molecules, thereby favoring crystallization. The use of NCCT offers the advantage of delivering charged particles onto the entire exposed surface of the crystallization solution, while at the same time minimizes the risk of contamination. Also, the use of this device is much simpler and easier to use than other devices with classic electrodes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/8197 |
| Date | 13 January 2015 |
| Creators | Μπολτσής, Ηλίας |
| Contributors | Πουλάς, Κωνσταντίνος, Boltsis, Ilias, Πουλάς, Κωνσταντίνος, Κοντογιάννης, Χρήστος, Σπυρούλιας, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
Page generated in 0.0031 seconds