Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChR) αποτελούν πρότυπα μέλη της υπεροικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων διαύλων ιόντων. Εμπλέκονται τόσο σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού, όσο και σε πολλές νόσους προσελκύοντας μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον. Οι nAChR διακρίνονται κυρίως σε νευρικού και μυϊκού τύπου. Ο νευρικός α4β2 nAChR έχει εκφραστεί και μελετηθεί με τεχνικές όπως πρόσδεση αγωνιστών-ανταγωνιστών και ηλεκτροφυσιολογικές αναλύσεις. Όμως δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ, πάνω σε αυτόν τον υποδοχέα δεν έχουν ακόμα αναφερθεί και πιθανή αιτία γι’ αυτό μπορεί να είναι και η ευέλικτη διαμόρφωση της κυτταροπλασματικής θηλιάς μεταξύ των διαμεμβρανικών ελίκων Μ3 και Μ4, η οποία μπορεί να εμποδίζει την ευαίσθητη από τη φύση της διαδικασία της κρυστάλλωσης των μεμβρανικών πρωτεϊνών.
Στην παρούσα μελέτη ο ανθρώπινος α4β2 nAChR εκφράστηκε τόσο σε κύτταρα εντόμων Sf9 με τη βοήθεια βακιλοϊού, όσο και σε ζυμομύκητες P. pastoris, σε δυο μορφές: Τον άγριου τύπου υποδοχέα (ΑΤ) και μια μορφή χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά (Κ). Στόχος της παρούσης μελέτης, ήταν η έκφραση ενός τύπου α4β2 nAChR με την καλύτερη δυνατή ποιότητα δομής και τα υψηλότερα δυνατά επίπεδα έκφρασης, ο οποίος θα ήταν κατάλληλος να χρησιμοποιηθεί σε δομικές μελέτες υψηλής ανάλυση όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ.
Αρχικά κατασκευάστηκαν ανασυνδυασμένοι βακιλοϊοί με τα cDNA των υπομονάδων των ΑΤ και Κ α4β2 υποδοχέων, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα εντόμων Sf9 αναγκάζοντάς τα να εκφράσουν τους υποδοχείς. Οι υπομονάδες των ΑΤ και Κ υποδοχέων ανιχνεύτηκαν εκφρασμένες σε κύτταρα εντόμων με στύπωμα western σε αναμενόμενα μοριακά βάρη, ενώ με πρόσδεση 125Ι-επιβατιδίνης αποδείχθηκε ότι οι α4 και οι β2 υπομονάδες είχαν ενωθεί μεταξύ τους μετά την έκφρασή τους και είχαν συγκροτήσει λειτουργικούς θύλακες πρόσδεσης ακετυλοχολίνης. Ο βέλτιστος χρόνος έκφρασης των υποδοχέων βρέθηκε να είναι τα 3 24ωρα, ενώ οι ιδανικές αναλογίες α4 προς β2 βακιλοϊών βρέθηκαν να είναι οι: 1:1 και 1:3. Η προσθήκη νικοτίνης στο θρεπτικό δεν βρέθηκε να έχει κάποια μετρήσιμη επίπτωση στην έκφραση ούτε του ΑΤ ούτε και του Κ υποδοχέα.
Πειράματα πρόσδεσης 3Η-επιβατιδίνης έδειξαν τη συγγένειά της με τον ΑΤ υποδοχέα να είναι 2 φορές υψηλότερη σε σχέση με τον Κ, ενώ στα ίδια πειράματα βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Κ υποδοχέα ήταν 7 φορές υψηλότερα από αυτά του ΑΤ. Πειράματα πρόσδεσης μη επισημασμένων προσδετών έδωσαν συγγένειες επίσης δυο φορές υψηλότερες για τον ΑΤ υποδοχέα σε σχέση με τον Κ. Επιπλέον πειράματα διαλυτοποίησης έδειξαν ότι οι βέλτιστες συνθήκες για την διαλυτοποίηση των υποδοχέων ήταν οι 25 oC και η χρήση του απορρυπαντικού Triton X-100. Στην ίδια σειρά πειραμάτων ο Κ υποδοχέας βρέθηκε να διαλυτοποιείται 4 φορές πιο αποδοτικά σε σχέση με τον ΑΤ. Τα πειράματα απομόνωσης και καθαρισμού συνεχίστηκαν μόνο με τον Κ υποδοχέα, λόγω καλύτερης διαλυτοποίησης και πολύ υψηλότερων επιπέδων έκφρασης που παρουσίαζε σε σχέση με τον ΑΤ.
Ο Κ α4β2 υποδοχέας απομονώθηκε και καθαρίστηκε αρχικά με χρωματογραφία συγγένειας ιόντων νικελίου και στη συνέχεια με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, η οποία έδειξε ότι ο Κ υποδοχέας είχε εκλουστεί σε όγκο έκλουσης συμβατό με το αναμενόμενο ΜΒ. Το γεγονός αυτό, μαζί με το γεγονός της πρόσδεσης επιβατιδίνης και άλλων προσδετών, πιστοποίησαν ότι οι ταυτόχρονα εκφραζόμενες α4 και β2 υπομονάδες συγκρότησαν υποδοχείς. Η ανάλυση του καθαρισμένου Κ α4β2 υποδοχέα με SDS PAGE και στύπωμα western έδειξε ότι ο υποδοχέας είχε απομονωθεί και καθαριστεί σε ικανοποιητικό βαθμό.
Η έκφραση των ΑΤ και Κ υποδοχέων στο στέλεχος GS 115 του ζυμομύκητα P. pastoris δεν ήταν το ίδιο επιτυχημένη με την αντίστοιχη έκφραση σε κύτταρα εντόμων. Οι υπομονάδες των υποδοχέων δεν ανιχνεύτηκαν στην ανάλυση με στύπωμα western, ενώ η ανάλυση με δέσμευση 3Η-επιβατιδίνης έδειξε ότι εκφράστηκαν σε επίπεδα πολύ χαμηλότερα σε σχέση με αυτά των κυττάρων εντόμων. Τέλος τα ποσοστά διαλυτοποίησης που επιτυγχάνονταν με τον ζυμομύκητα P. pastoris ήταν επίσης πολύ χαμηλότερα από τα αντίστοιχα των κυττάρων εντόμων, οπότε η μελέτη δεν προχώρησε περεταίρω με αυτό το σύστημα έκφρασης.
Συμπερασματικά μέσα από την παρούσα μελέτη, προέκυψε ένας ανθρώπινος νευρικός α4β2 nAChR χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά, εκφρασμένος σε κύτταρα εντόμων με τη βοήθεια βακιλοϊού, ο οποίος εκφράζεται και διαλυτοποιείται πολύ περισσότερο από τον φυσικό υποδοχέα και επιπλέον μπορεί να απομονωθεί και να καθαριστεί σχετικά εύκολα. Η απουσία της εύκαμπτης κυτταροπλασματικής θηλιάς αναμένεται να διευκολύνει τον σχηματισμό κρυστάλλων του υποδοχέα στα πειράματα κρυστάλλωσης, τα οποία έχουν ήδη ξεκινήσει, καθώς και την ανάλυση των δεδομένων εφόσον προκύψουν πρωτεϊνικοί κρύσταλλοι.
Τέλος οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση ΑΤ και Κ α4β2 nAChR μεταξύ κυττάρων εντόμων και ζυμομύκητα P. pastoris, ελέγχθηκαν εκφράζοντας στα συστήματα αυτά μια μικρότερη, συγγενική πρωτεΐνη, η οποία αποτελείτο μόνο από το ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου μυϊκού τύπου nAChR. Το εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων α1-ECD (i-α1-ECD) βρέθηκε να έχει μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενών σε σχέση με το εκφρασμένο σε ζυμομύκητα P. pastoris (y-α1-ECD), καθώς επίσης μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR mAb, αποτελέσματα τα οποία μαζί με αντίστοιχα του κυκλικού διχρωϊσμού έδειξαν βελτιωμένη δομή, επιβεβαιώνοντας ότι τα κύτταρα εντόμων εκφράζουν καλύτερα nAChR σε σχέση με το ζυμομύκητα P. pastoris. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι το i-α1-ECD είναι καταλληλότερο τόσο για δομικές μελέτες όσο και για βελτιωμένες θεραπείες της βαριάς μυασθένειας. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are models for the superfamily of pentameric ligand gated ion channels. They are involved both in many physiological functions and in many diseases, attracting major scientific interest. nAChRs are distinguished in muscle and neuronal type. Neuronal α4β2 nAChRs have been expressed and studied using ligand binding and electrophysiology technics. Nevertheless high resolution structural studies like X-ray crystallography have not yet been referred, and one main reason for that may be the flexible conformation of the cytoplasmic loop between the transmembrane helixes M3 and M4, which is very likely to prevent the membrane protein crystallization process.
In the present study the wild type (WT) human α4β2 nAChR and a truncated construct (T), that lacked the cytoplasmic loop, were expressed both in Sf9 insect cells using baculovirus and in the yeast Pichia pastoris. The aim of the present study was the expression and purification of a human α4β2 nAChR type receptor, suitable for use in high resolution structure analysis, and especially in X-ray crystallography.
Recombinant baculoviruses were constructed, containing the α4β2 nAChR subunits cDNAs. They were used to infect Sf9 insect cells, made them to coexpress the WT or T α4 and β2 subunits. WT and T receptor subunits were detected expressed in the expected molecular weights, while 125Ι-epibatidine binding proved that α4 and β2 subunits had formed ligand binding sites. The best expression time was found to be 72 hours post infection and the best α4/β2 recombinant baculovirus ratios were found to be between 1:1 and 1:3. Nicotine addition to the medium did not make any difference in the expression levels.
3Η-epibatidine binding studies showed 2 times stronger affinity for the WT than the T receptor and 7 times higher expression levels for the T than the WT receptor. Non labeled ligand binding studies showed also 2 times stronger affinity for the WT than the T nAChR. Other experiments indicated that 25 oC and the Triton X-100 detergent were the best combination for the receptor’s solubilization. Other solubilization experiments showed T nAChR solubilized 4 times better than the WT. Purification experiments continued only for T construct due to its higher expression levels and better solubilization efficiency.
T α4β2 receptor was originally purified using ion metal affinity chromatography and subsequently gel filtration chromatography, which showed that T receptor has elution volume compatible with the expected MW. This result together with the receptors’ ligand binding capabilities certified that the coexpressed α4 and β2 subunits formed oligomeric receptors. SDS PAGE and western blot analysis indicated that T nAChR was satisfactory purified.
The expression of the WT and T receptors in the strain GS 115 of the yeast P. pastoris was not as successful as the expression in insect cells. Receptor subunits were not detected using western blot analysis, whereas 3Η-epibatidine binding studies indicated expression levels much lower than that of insect cells. Finally, solubilization of the yeast expressed WT and T α4β2 nAChRs was very poor compared with that of insect cells. Due to all the above results, the yeast expression of the WT and T nAChRswas discontinued.
In conclusion, by the present study, a new human α4β2 nAChR without cytoplasmic loop was emerged, expressed in sf9 insect cells using baculovirus, with much higher expression levels and solubilization yields than that of the natural receptor and capable for easy purification. The absence of the unordered cytoplasmic loop is expected to facilitate the crystal formation and the analysis of any protein crystals might derive from the crystallization efforts which have been already started.
Finally, the differences of the expressed WT and T α4β2 nAChRs between insect cells and the yeast P. pastoris were further confirmed by expressing a small, related protein, the ECD of the α1 subunit of human muscle nAChR in both systems and comparing the two expressed α1 ECDs. The insect expressed α1 ECD (i-α1-ECD) was found to have higher immunoadsorption capacity for anti-nAChR autoantibodies from myasthenia patients sera than the yeast expressed (y-α1-ECD) and also higher binding ability for anti-nAChR mAbs. These results together with circular dichroism results showed a more native-like structure for the i-α1-ECD, confirming that insect cells express better nAChRs comparing to the yeast P. pastoris. Furthermore it was proved that i-α1-ECD was a better candidate for structural studies and more suitable for selective myasthenia gravis therapies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/7472 |
| Date | 16 May 2014 |
| Creators | Νιάρχος, Αθανάσιος |
| Contributors | Πατρινός, Γεώργιος, Niarchos, Athanasios, Πατρινός, Γεώργιος, Τζάρτος, Σωκράτης, Πουλάς, Κωνσταντίνος, Κοντογιάννης, Χρήστος, Σπυρούλιας, Γεώργιος, Παπαδημητρίου, Ευαγγελία, Αυγουστάκης, Κωνσταντίνος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0042 seconds