Projet I :
Les endospores représentent un état de dormance des bactéries leur permettant de résister à des conditions extrêmes et de persister pendant des années. La formation d'endospores a façonné l'évolution puisqu’elle se produit exclusivement chez les Firmicutes. Plusieurs études ont rapporté la formation d'endospores chez des espèces en dehors des Firmicutes, en particulier chez deux espèces de Protéobactéries, Rhodobacter johrii et Serratia marscescens, et une espèce d'Actinobacteries, Mycobacterium marinum. Le fait d’identifier les endospores en dehors des Firmicutes pourrait affecter la forme de l'arbre de vie et aiderait dans notre lutte contre les agents pathogènes humains. Par conséquent, nous avons visé d’étudier l'endosporulation chez ces trois espèces en utilisant des approches avancées d'imagerie et d'analyse, y compris la microscopie corrélative alliant la microscopie optique et électronique (CLEM), la tomographie de cryo- électron (cryo-ET) et la lipidomique. Nous avons utilisé la bactérie sporulante bien caractérisée Bacillus subtilis comme contrôle positif de la sporulation. L'examen de R. johrii, S. marcescens et M. marinum en utilisant CLEM et cryo-ET a montré que les objets à phase brillante ne ressemblaient à aucun stade de l'endosporulation. Les cryo-tomogrammes ont montré que les objets à phase brillante chez S. marcescens étaient des débris cellulaires agrégés de cellules mortes, alors qu'ils présentaient des structures granulaires typiques des cellules bactériennes chez les R. johrii et M. marinum. L'analyse lipidomique chez R. johrii a identifié les structures granulaires comme des granules de stockage potentiels enrichis en triacylglycérides (TAG). Nous pensons que les TAG peuvent fournir une source d'énergie pour résister à l'épuisement des nutriments. Des approches biochimiques et bioinformatiques supplémentaires ont soutenu nos conclusions selon lesquelles R. johrii, S. marcescens et M. marinum sont des bactéries non sporulantes.
Projet II :
Les plasmides jouent un rôle vital dans la propagation des gènes de résistance au sein et entre les espèces bactériennes. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les systèmes bactériens impliqués dans le transfert et la maintenance des plasmides pour mieux aider dans notre lutte contre la propagation de la résistance aux antibiotiques. Dans cette thèse de doctorat, nous avons cherché à caractériser l'opéron alp7ARC, en utilisant l'homologue de l'actine bactérienne Alp7A pour séparer le plasmide pLS20 codant pour la résistance à la tétracycline dans B. subtilis. La stabilité du plasmide s'est avérée dépendante de l'opéron alp7ARC, indiquant un rôle essentiel dans la ségrégation plasmidique. Nos résultats préliminaires sur Alp7A ont montré qu'il s'assemble dans une nouvelle nanostructure tubulaire plutôt que des filaments, suggérant un nouveau mécanisme de ségrégation de l'ADN par Alp7A. Nous avons également étudié la structure d'Alp7A in vivo en utilisant une combinaison d'approches, notamment la biologie moléculaire, la Cryo-ET et la fLM. Nous avons également utilisé la CLEM pour localiser Alp7A dans des cellules entières à une résolution macromoléculaire. En outre, nous avons étudié la structure et la fonction d'Alp7A in vitro en transfectant B. subtilis et E. coli avec diverses constructions plasmidiques incorporant des mutations dans le gène d’Alp7A. Nous avons déployé différentes méthodes pour la purification de la protéine Alp7A, y compris la séparation par chromatographie, et le fractionnement au sulfate d'ammonium. J'ai discuté des divers défis que nous avons rencontrés dans ces expériences, tels que la contamination, l'instabilité de la protéine Alp7A et l'épaisseur bactérienne. Enfin, j'ai proposé des approches expérimentales alternatives qui aideraient à étudier le mécanisme de ségrégation des plasmides par Alp7ARC. / Project I:
Endospores represent a dormant state of bacteria that allows them to withstand extreme conditions and persist for years. Endospore formation has shaped evolution, whereby it exclusively occurs in Firmicutes. Several studies have reported endospore formation in species outside of Firmicutes, particularly in two species of Proteobacteria, Rhodobacter johrii and Serratia marcescens, and one species of Actinobacteria, Mycobacterium marinum. Identifying endospores outside of Firmicutes would affect the shape of the tree of life and aid in our fight against human pathogens. Therefore, we aimed to investigate endosporulation in these three species using advanced imaging and analytical approaches, including correlative light and electron microscopy (CLEM), cryo-electron tomography (cryo-ET), and lipidomics. We used the well-characterized sporulating bacterium Bacillus subtilis as a positive control of sporulation. Examination of R. johrii, S. marcescens, and M. marinum using CLEM and cryo-ET showed that phase-bright objects did not resemble any stages of endosporulation. Cryo-tomograms revealed that the phase-bright objects in S. marcescens were aggregated cellular debris of dead cells, whereas they displayed granular structures typical of bacterial cells in R. johrii and M. marinum. Lipidomic analysis in R. johrii identified the granular structures as potential storage granules enriched with triacyl-glycerides (TAGs). We speculate that TAGs may provide an energy source to withstand the nutrient depletion. Additional biochemical and bioinformatics approaches supported our conclusions that R. johrii, S. marcescens, and M. marinum are non-sporulating bacteria.
Project II:
Plasmids play a vital role in the spread of resistance genes within and across bacterial species. Therefore, it is essential to understand the bacterial systems involved in the transfer and maintenance of plasmids to better aid in our fight against the spread of antibiotic resistance. In this doctorate, we aimed to characterize the alp7ARC operon, employing the bacterial actin homolog Alp7A to segregate the tetracycline resistance-encoding plasmid pLS20 in B. subtilis. The stability of the plasmid was shown to be dependent on the alp7ARC operon, indicating an essential role in plasmid segregation. Preliminary results on Alp7A showed that it assembles into a novel tubular nanostructure rather than filaments, suggesting a novel mechanism for DNA segregation by Alp7A. We further studied the structure of Alp7A in vivo using combination of approaches, including molecular biology, cryo-ET, and fLM. We also used CLEM to localize Alp7A in whole cells to a macromolecular resolution. Besides, we investigated the structure and function of Alp7A in vitro by transfecting E. coli with various plasmid constructs and purification by several methods, including affinity chromatography and ammonium sulfate precipitation. I discussed the diverse challenges we encountered in these experiments, such as bacterial thickness, contamination, and Alp7A protein instability. Finally, I proposed alternative experimental approaches for investigating the mechanism of plasmid segregation by Alp7ARC.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/26868 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Fakih, Doaa |
| Contributors | Nanci, Antonio |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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