La résistance antimicrobienne est devenue un problème majeur de santé publique. L’usage parfois abusif d’antibiotiques conduit à la sélection et à la propagation mondiale de mécanismes de résistance. Grâce à leur efficacité clinique et faible toxicité, les β-lactamines sont les antibiotiques les plus prescrits actuellement, et le mécanisme de résistance le plus répandu est l’expression de β-lactamases. Dans ces conditions, le développement de nouveaux traitements antimicrobiens, pour des cibles connues ou nouvelles, est essentiel. Plus particulièrement, le développement de nouveaux inhibiteurs des β-lactamases est très prometteur, permettant de continuer l’utilisation des antibiotiques existants. Les études biochimiques et structurales des nouvelles β-lactamases et leurs mutants synthétiques, par cristallographie aux rayons X ou par différentes techniques de modélisation moléculaire (modélisation par homologie, « docking », dynamique moléculaire, analyse du réseau des molécules d’eau) permettent une meilleure compréhension de ces enzymes. Dans ce contexte, nous avons caractérisé plusieurs β-lactamases du point de vue phénotypique, biochimique et structural.La β-lactamase CMY-136 contient une mutation inhabituelle, Y221H, par rapport à CMY-2, dans une position qui est très conservée parmi les enzymes de classe C. Les études cristallographiques et de modélisation moléculaire ont révélé des interactions stériques défavorables autour de la position mutée 221 qui peuvent affecter la conformation et la dynamique de la boucle Ω, et qui pourraient expliquer l’hydrolyse plus efficace des substrats volumineux et l’affinité plus faible de la plupart des substrats par rapport à la CMY-2.La structure cristallographique de la β-lactamase OXA-427, une nouvelle carbapénèmase de classe D, montre une Lys73 très peu carbamoylée, ce qui est très inhabituel pour cette classe d’enzyme, ainsi qu’un pont hydrophobe à proximité du site actif. Les simulations de dynamique moléculaire ont montré que la boucle β5-β6 est plus flexible et dans une conformation étendue. Ces résultats peuvent expliquer le profil d’hydrolyse unique observé expérimentalement pour cette enzyme.Les modifications dans la boucle β5-β6 de la β-lactamase OXA-48 (mutations d’alanines, délétions systematiques, remplacement par la boucle β5-β6 de la β-lactamase OXA-18) provoquent des modifications importantes dans le profil d’hydrolyse, avec une acquisition graduelle d’une activité cephalosporinase et une diminution de l’activité carbapénémase dans certains cas. Des études de cristallographie aux rayons X et modélisation moléculaire suggèrent que les différences de conformation et de flexibilité dans cette boucle et les régions adjacentes permettent une meilleure fixation des céphalosporines plus volumineuses, par rapport à l’OXA-48. L’analyse de la dynamique des molécules d’eau dans le site actif montre des changements qui sont potentiellement responsables de la diminution de l’activité par rapport aux carbapénèmes. En complément des études sur les mutants naturels, ces résultats confirment l’importance de la boucle β5-β6 pour la spécificité de substrat des enzymes de type OXA-48. La structure cristallographique du mutant 217ΔP de l’OXA-48 présente une conformation auto-inhibée inattendue, induite par la présence d’un ion nitrate, un inhibiteur auparavant inconnu des β-lactamases de classe D.La Beta-Lactamase DataBase(BLDB, http://bldb.eu) développée dans notre équipe est une ressource publique exhaustive contenant des données relatives aux β-lactamases, vérifiées et mises à jour régulièrement. Cette base de données contient tous les mutants naturels et synthétiques de β-lactamases, ainsi que toutes les structures 3D disponibles dans la PDB et la caractérisation phénotypique.Globalement, ces résultats représentent le prérequis pour une meilleure compréhension des relations structure-fonction des β-lactamases et pour le futur développement rationnel d’inhibiteurs pour ces enzymes. / Antimicrobial resistance (AMR) has become a major threat to public health nowadays. The use and abuse of antibiotics is increasingly leading to selection and spread of resistance mechanisms worldwide, greatly compromising our capacity to treat infectious diseases. AMR might ultimately result in a future without effective antimicrobial therapy. Due to their safety and clinical efficacy, β-lactams are the most utilized antimicrobial therapy, and the most common resistance mechanism is the expression of β-lactamases. Therefore, the development of new antimicrobial drugs, for novel or already known targets, is of utmost importance. In particular, the development of novel inhibitors towards β-lactamases is also quite promising, as it would allow us to continue using the effective and safe antimicrobial drugs already available today. The biochemical and structural study of novel β-lactamases or synthetic mutants, through X-ray crystallography and various molecular modelling techniques (homology modelling, docking, molecular dynamics, water network analysis), can provide valuable information. In this context, we have characterized phenotypically, biochemically and structurally several β-lactamases.The CMY-136 β-lactamase possesses an unusual mutation, Y221H, as compared to CMY-2, in a position highly conserved among class C ß-lactamases. Crystallographic and molecular modelling experiments reveal a steric impediment around the mutated position 221 that may affect the conformation and dynamics of the Ω-loop, and therefore account for an increased turnover rate for bulky substrates and a decreased affinity for most substrates as compared to CMY-2.The crystal structure of the OXA-427, a novel class D carbapenemase, shows the Lys73 only partially carbamoylated, a very unusual characteristic for this class of β-lactamases, and an unexpected hydrophobic bridge in the vicinity of the active site. Moreover, molecular dynamics simulations revealed an extended and highly flexible β5-β6 loop. Altogether, these features may explain the unique hydrolytic profile determined experimentally for this enzyme.Modifications in the β5-β6 loop of the OXA-48 β-lactamase (alanine scanning, systematic deletions, replacement with the β5-β6 loop from OXA-18) result in profound changes in the hydrolytic profile, with gradual acquisition of cephalosporinase activity and decrease of carbapenemase activity in some cases. X-ray crystallography and molecular modelling studies suggest that the altered conformation and flexibility of this loop and of adjacent regions in these mutants may allow for the better accommodation of the bulkier cephalosporins, compared to OXA-48. Additionally, water dynamics analysis highlighted changes in the water network around and inside the active site cavity that may be responsible for the lower activity towards carbapenems. Together with studies on other naturally occurring mutants, results corroborate the relevance of the β5-β6 loop on the substrate profile of OXA-type enzymes. Crystal structure of the OXA-48 217ΔP mutant reveals an unexpected self-inhibited conformation induced by the presence of a nitrate ion, a previously unknown inhibitor of class D β-lactamases.Finally, the Beta-Lactamase DataBase (BLDB, http://bldb.eu) developed in our laboratory is a comprehensive, manually curated public resource providing up-to-date structural and functional information on β-lactamases. It contains all reported naturally-occurring β-lactamases and synthetic mutants, together with all available 3D structures from the PDB and the phenotypical characterization.Overall, these results constitute an essential foundation for a better understanding of the structure-function relationship of β-lactamases, which may prove crucial for the future rational development of β-lactamase inhibitors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018SACLS567 |
| Date | 19 December 2018 |
| Creators | Zavala, Agustin |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Naas, Thierry, Iorga, Bogdan |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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