Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Infection with hepatitis A virus (HAV) occurs worldwide and is the most common cause of acute viral hepatitis. The highest prevalence of this infection is seen where low standards of sanitation are adopted. Acquired primarily by the fecaloral
route, HAV infection is easily disseminated, either by person-to-person contact or by ingestion of contaminated food or water. The HAV is a extremely steady non-enveloped particle, which comprises a single stranded plus-sense RNA with approximately 7,5 kb. The objective of this study was to develop, based into VP1 gene sequence, a DNA probe from the HAV genome by RTPCR to detect the virus. A 783 bp amplicon of HAV genome (Brazilian standard strain HAF-203), amplified by RT-PCR was labelled by coupling of alkaline
phosphatase enzyme from Gene ImagesTM AlkPhos DirectTM System (Amersham). Specificity was determined by dot blot hybridization of RNA from standard strain HAF-203 and DNA of the own amplicon. To asses the sensitivity of detection hybridization was done in serially diluted up to 1 pg of purified viral RNA. Sewage water samples were artificially ontaminated with dilutions up to 10 PFU/mL of the virus. The particles were precipitated with amonium sulfate and the total RNA obtained by treatment with proteinase k and phenol:chloroform. Samples were transferred to a nylon membrane by dot blot and hybridized according to labelling system manufacturer s instructions. Dots were detected in spots containing 1 pg of purified RNA, just like the amplicon.
The DNA probe did not hybridize to total DNA prepared from BoHV-1, XL2B DNA and Human total RNA. The probe hybridized to samples containing up to 100 PFU/mL of the virus. This results showed the probe specificity and
sensitivity level is sufficient to detect the virus in environmental samples, making this technique able to be used in environmental molecular monitoring of the virus. / Infecção pelo vírus da hepatite A (HAV) acontece mundialmente e é a causa mais comum de hepatites virais agudas. A prevalência mais alta desta infecção é observada onde baixos padrões de serviço de saúde pública são adotados. Adquirida principalmente pela rota fecal-oral, a infecção por HAV é disseminada facilmente, através de contato de pessoa-para-pessoa ou por ingestão de comida ou água contaminada. O HAV é uma partícula não envelopada, extremamente estável que possui RNA fita simples de sentido
positivo com aproximadamente 7,5 kb. O objetivo deste estudo foi desenvolver, baseado na seqüência do gene VP1, uma sonda de DNA a partir do genoma de HAV por RT-PCR para detectar o vírus. Um amplicon de 783 bp do genoma
de HAV (amostra padrão HAF-203), amplificado por RT-PCR foi marcado pela enzima fosfatase alcalina do sistema Gene ImagesTM AlkPhos DirectTM (Amersham). A especificidade foi determinada por hibridização em dot blot com RNA da amostra padrão brasileira HAF-203 e DNA do próprio amplicon. Para
testar a sensibilidade de detecção por hibridização foi realizada diluição seriada até 1 pg de RNA viral purificado. Foram contaminadas artificialmente amostras de água de esgoto com diluições até 10 PFU/mL do vírus. As partículas foram precipitadas com sulfato de amônia e RNA total obtido através de tratamento com proteinase k e fenol:clorofórmio. Amostras foram transferidas para uma membrana de nylon por dot blot e hibridizadas de acordo com as instruções do
fabricante do sistema. A sonda detectou amostras nos poços contendo até 1 pg de RNA purificado, da mesma forma que o amplicon. A sonda de DNA não hibridizou com DNA preparado de BoHV-1, XL2B DNA e RNA total Humano. A sonda hibridizou com amostras que contêm até 100 PFU/mL do vírus. Estes
resultados mostram que a os níveis de especificidade e sensibilidade da sonda é suficiente para detectar o vírus em amostras ambientais, tornando esta técnica aplicável no monitorando molecular ambiental do vírus.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:ri.ufs.br:riufs/3727 |
| Date | 27 September 2007 |
| Creators | Santos, Matheus Ismerim Silva |
| Contributors | Cândido, Alexandre Luna |
| Publisher | Universidade Federal de Sergipe, Pós-Graduação em Ciências da Saúde, UFS, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFS, instname:Universidade Federal de Sergipe, instacron:UFS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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