O trocador de Na+/Ca2+ (NCX) constitui um dos principais mecanismos de extrusão de Ca2+ intracelular em células excitáveis. Foi demonstrado que alterações no funcionamento do NCX estão relacionadas a diversas situações patológicas. Por este motivo, o entendimento do mecanismo molecular da manutenção da concentração de Ca2+ intracelular via NCX é importante para a compreensão do funcionamento do trocador, bem como para o desenvolvimento de fármacos. Além de transportar Na+/Ca2+, o NCX também é regulado por esses íons. Este trocador é composto por dois domínios transmembranares, cada um deles contendo 5 α-hélices (TM), e uma grande alça intracelular que conecta as hélices TM5 e TM6. O domínio transmembranar é responsável por catalisar o transporte de Na+/Ca2+ através da bicamada lipídica, enquanto que a alça citoplasmática está envolvida com a regulação do trocador. Esta alça contém dois domínios sensores de Ca2+ adjacentes, denominados CBD1 e CBD2. Apesar da importância fisiológica do NCX, o mecanismo de regulação alostérica do trocador por Ca2+ intracelular permanece desconhecido. Neste trabalho, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de alta resolução foi utilizada para investigar a conformação e a dinâmica de CBD1 e CBD2 do trocador de Na+/Ca2+ de Drosophila melanogaster (CALX), isolados ou conectados covalentemente em uma construção denominada CBD12. Um total de 98% das ressonâncias da cadeia principal de CBD1 isolado na presença de Ca2+ foi assinalado, enquanto que na ausência de Ca2+, assinalamentos para apenas uma parte da cadeia principal puderam ser obtidos. Os assinalamentos adquiridos para CBD12 foram baseados na análise de um conjunto de espectros de RMN tridimensional heteronuclear e por comparação com os espectros dos domínios isolados. Uma análise preliminar dos deslocamentos químicos e dos parâmetros de relaxação de 15N obtidos para CBD1 indicou que este domínio é flexível na ausência de Ca2+, mas torna-se rígido após a adição deste íon. As medidas das velocidades de relaxação de 15N e de acoplamentos dipolares residuais (RDCs) de 1H-15N realizadas para CBD12 nas formas apo e holo indicaram que a ligação de Ca2+ em CBD1 estabiliza uma orientação rígida entre os domínios. A análise dos RDCs de 1H-15N mostrou ainda que a orientação média entre CBD1 e CBD2 é praticamente linear na ausência de Ca2+, enquanto que um ângulo menor é assumido após a adição deste íon. Os dados descritos nesta tese suportam um modelo de regulação alostérica em que a modulação da plasticidade de CBD12 pela ligação de Ca2+ no domínio CBD1 controla a abertura e o fechamento do trocador. / The Na+/Ca2+ exchanger (NCX) is a major mechanism for the extrusion of intracellular Ca2+ in excitable cells. It was demonstrated that altered functioning of this protein is related to various pathological situations. Therefore, the understanding of the molecular mechanism for maintaining the intracellular Ca2+ concentration by means of the NCX is important to understand the functioning of the exchanger and to develop drug-based therapies. Besides transporting Na+/Ca2+, the exchanger is also regulated by these ions. The NCX is composed of two transmembrane domains, each of them containing 5 transmembrane alpha-helices (TM), and a very large cytosolic loop that connects TM5 to TM6. The transmembrane domains are responsible for catalyzing the transport of Na+ and Ca2+ ions across the lipid bilayer, while the cytosolic loop is involved in regulation of the exchanger activity. It contains two regulatory Ca2+- binding domains, called CBD1 and CBD2, that appear in tandem. Despite the physiological importance of the NCX, the mechanism of allosteric regulation of the exchanger by intracellular calcium remains unclear. In this work we used high-resolution NMR spectroscopy to study the conformation and the dynamics of the two Ca2+-binding regulatory domains of Drosophila\'s Na+/Ca2+ exchanger (CALX), CBD1 and CBD2, in isolation as well as in a covalent construct called CBD12. Complete backbone NMR resonance assignments were obtained for the isolated CBD1 domain in the Ca2+-bound state, while partial assignments were obtained for CBD1 in the free state. Partial backbone NMR resonance assignments were obtained for the CBD12 construct through the analysis of a standard set of triple resonance NMR spectra. Additional assignments were obtained by comparison with the isolated CBD1 and CBD2 domains. A preliminary analysis of NMR chemical shifts and 15N relaxation data obtained for CBD1 indicates that this domain displays considerable amount of flexibility in the free state, but becomes more rigid upon Ca2+-binding. NMR 15N relaxation rates and 1H-15N residual dipolar couplings (RDCs) obtained for the Apo and Ca2+-bound states of the CBD12 domain indicate that calcium binding stabilizes a rigid inter-domain orientation. Analysis of 1H-15N RDCs further shows that Drosophila\'s CBD12 domain assumes an almost linear inter-domain orientation in the absence of Ca2+, while a smaller inter-domain angle was found in its presence. These findings support a model in which modulation of CBD12 plasticity by the binding of Ca2+ to the CBD1 domain controls the opening and closing of the exchanger.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20072015-115123 |
| Date | 20 March 2015 |
| Creators | Abiko, Layara Akemi |
| Contributors | Basso, Ernani Abicht, Salinas, Roberto Kopke |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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