O alumínio (Al) é o metal mais abundante na natureza e tornou-se importante poluente aquático trazendo prejuízos a reprodução de teleósteos, atuando como um desregulador endócrino. No entanto, em experimentos in vivo não é possível demonstrar que os efeitos do Al no eixo endócrino reprodutivo são devido a sua atuação direta sobre os órgãos que o compõem. Por isso, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito direto do Al sobre células foliculares ovarianas, gonadotrópicas e somatolactínicas hipofisárias de fêmeas maduras de Oreochromis niloticus. Para isso dois experimentos in vitro de exposição ao Al foram realizados: um utilizando-se ovários maduros e outro hipófises de fêmeas sexualmente maduras. Para os experimentos ovarianos, frações de ovários maduros foram incubadas por 4 horas formando os seguintes grupos: 1) Grupo controle (Ctr): tecido ovariano exposto somente à solução de Krebs-Ringer-glucose-HEPES; 2) Grupo gonadotropina coriônica humana (hCG): tecido exposto à 6 µg/ml de hCG (Ovidrel); 3) Grupo (hCG+Al): tecido exposto à 6 µg/ml de hCG (Ovidrel) + cloreto de alumínio (AlCl3) - 10mM; 4) Grupo (Al): exposto somente ao AlCl3 - 10mM. A concentração dos hormônios 17β-estradiol (E2) e 17α-hidroxiprogesterona (17αOHP) no meio de incubação foi determinada por ELISA. Para os experimentos hipofisários, hipófises de fêmeas sexualmente maduras foram incubadas por 24 horas formando os seguintes grupos: 1) Ctr: hipófise exposta somente ao meio L15 (controle interno); 2) GnRH: hipófise exposta somente ao GnRH (controle de liberação de gonadotropinas); 3) GnRH+Al: hipófise exposta ao GnRH + AlCl3 10mM e 4) Al: hipófise exposta somente AlCl3 10mM. Após o período experimental, foram realizadas análises de qPCR (PCR quantitativo), análises de imunohistoquímica, e de microscopia eletrônica. Os resultados do experimento ovariano mostraram que os fragmentos ovarianos do grupo exposto à hCG apresentaram um aumento significativo da liberação dos hormônios E2 e 17αOHP em relação aos demais grupos, confirmando o efeito desta gonadotropina sintética na liberação destes esteroides gonadais. No entanto, a administração conjunta da hCG com Al (hCG+Al) não gerou este aumento da produção dos esteroides em relação ao grupo controle. Estes dados evidenciam que o Al inibiu a resposta celular das células esteroidogênicas ovarianas às gonadotropinas. Os resultados dos experimentos hipofisários mostraram que o Al (GnRH+Al e Al) afetou a expressão gênica dos genes estudados (βFSH, (βLH, SL) inclusive dos normalizadores (EF1α e (βAc), o que tem sido comum em experimentos de ecotoxicologia. Os dados de microscopia eletrônica mostraram desestruturação celular nas hipófises que foram expostas ao Al e as análises de imunohistoquímica apontaram que o Al (GnRH+Al e Al) não interferiu sobre a quantidade de grânulos de βLH e SL, enquanto o grupo Al indicou uma diminuição na quantidade de grânulos de βFSH, sugerindo que o Al afeta a dinâmica de síntese/liberação desta gonadotropina. Estes dados evidenciam a toxicidade do Al diretamente sobre ambos os órgãos estudados, tanto em nível de resposta celular quanto em nível estrutural confirmando o potencial do Al como um DE e amplia as perspectivas de estudo sobre o mecanismo de ação do Al como um DE / Aluminum (Al) is the most abundant metal in nature and has become an important water pollutant impairing reproduction of teleosts, acting as an endocrine disrupter. However, in vivo experiments cannot demonstrate that the effects of Al on the reproductive endocrine axis are due to direct action on the organs that compose it. Therefore, this study aimed to assess the direct effect of Al on ovarian follicular cells, gonadotropic and somatolactin pituitary cells of mature females of O. niloticus. For this, two in vitro exposure experiments of Al were performed: one using mature ovaries and other using pituitaries of sexually mature females. For ovarian experiments, fractions of mature ovaries were incubated for 4 hours to obtain the following groups: 1) control group (Ctr): ovarian tissue only exposed to Krebs- Ringer-HEPES-glucose; 2) human chorionic gonadotropin (hCG) group: tissue exposed to 6 mg/ml hCG (Ovidrel); 3) hCG + Al group: tissue exposed to 6 mg/ml hCG (Ovidrel) + aluminum chloride (AlCl3) - 10mM; 4) Al group: only exposed to 10 mM AlCl3. The concentration of the hormones 17β-estradiol (E2) and 17α-hydroxyprogesterone (17αOHP) in the incubation medium was determined by ELISA. For pituitary experiments, pituitaries of sexually mature females were incubated for 24 hours to form the following groups: 1) Ctr: pituitary exposed only to L15 (internal control); 2) GnRH: only exposed to the pituitary GnRH (gonadotropin releasing hormone); 3) GnRH + Al: exposed to the pituitary GnRH AlCl3 + 10 mM and 4) Al: 10mM AlCl3 only exposed pituitary. After the assay period, analysis of qPCR (quantitative PCR), analysis of immunohistochemistry and electron microscopy were performed. The results of the experiment showed that the ovarian exposed to hCG group showed a significant increase in the release of E2 and 17αOHP compared to the other groups, confirming the effect of synthetic gonadotropin in the release of these gonadal steroids. However, the administration combined of hCG with Al (Al + hCG) did not generate this increased production of steroids compared with the control group. These data show that Al inhibited the cellular response of the ovarian steroidogenic cells to gonadotropins. The results of the experiments with pituitaries showed that Al (GnRH + Al and Al) affected the gene expression of the genes studied (βFSH, (βLH, SL) including the house keeping genes (EF1α and βAc), what has been common in ecotoxicology experiments. Data from electron microscopy showed cell disruption in the pituitary glands that were exposed to Al and immunohistochemical analyzes showed that Al (GnRH + Al and Al) did not affect the amount of granules of βLH and SL, while the Al group indicated a decrease the amount of βFSH granules, suggesting that Al affects the dynamics of the synthesis/release of this gonadotropin. These data show the toxicity of Al directly on both organs studied, at both the cellular response as for structural level confirming the potential of Al as a DE and increases the perspectives of study on the mechanism of action of Al as a DE
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02062014-141624 |
| Date | 19 February 2014 |
| Creators | Narcizo, Amanda de Moraes |
| Contributors | Whitton, Renata Guimarães Moreira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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