Les 6-O-endosulfatases HSulf-1 et HSulf-2 (HSulfs) catalysent l'hydrolyse régio-sélective du groupe 6-O sulfate des résidus glucosamine sulfatés de l'héparane sulfate (HS), assurant ainsi une modification post-synthétique unique de ce glycosaminoglycane constitutif des protéoglycanes de la surface cellulaire. Par cette action, les HSulfs modulent les propriétés d'interaction de HS avec un grand nombre de ligands, faisant de ces enzymes des acteurs cruciaux dans de nombreux processus physiopathologiques. De nombreuses études ont souligné le rôle physiologique de HSulf-2 ainsi que son implication dans des processus pathologiques, en particulier du cancer. HSulf-2 est ainsi proposée comme une cible thérapeutique prometteuse dans la recherche anti-cancéreuse. Néanmoins, à l'heure actuelle, aucune structure cristallographique d'endosulfatase Sulf-2 n'a été décrite. Dans le présent travail de thèse, nous présentons la première caractérisation par spectrométrie de masse (MS) de HSulf-2. Une masse moléculaire moyenne de 133115 g.mol-1 a été déterminée pour l'enzyme entière par MS MALDI-TOF. Cette masse expérimentale plus élevée que la masse théorique (98169,86 g.mol-1) déduite de la séquence d'acides aminés, souligne la contribution significative de modifications post-traductionnelles (MPTs) à la masse moléculaire totale de HSulf-2. La séquence protéique de HSulf-2 a été confirmée par analyse nano-LC-MS/MS, ce qui a permis de localiser quatre sites de N-glycosylation (N108, N147, N174 et N217) sur les sept sites potentiels de la chaîne longue. Outre cette N-glycosylation, nous avons également identifié une nouvelle MPT de type O-glycosylation. En combinant différentes approches d'électrophorèse (SDS-PAGE / C-PAGE) et de MS (MALDI-TOF et HILIC-ESI-MS) nous avons montré que cette PTM est constituée d'une chaîne de glycosaminoglycane (GAG) appartenant à la famille des chondroïtine sulfate/dermatane sulfate. L'analyse par MALDI-TOF de la forme modifiée HSulf-2 dans laquelle les deux seuls sites d'ancrage possibles de ce GAG ont été substitués, a permis de déduire une contribution globale des MPTs de 34964 g.mol-1, dont 24727 g.mol-1 pour la seule chaîne de GAG. Cette dernière est greffée de manière covalente au niveau du domaine HD de la chaîne courte. Elle représente une modification inédite pour une enzyme, premier exemple connu d'un protéoglycane de ce type. Plusieurs N-glycosylations réparties sur les deux chaînes longue et courte comptent pour les 10237 g.mol-1 restant. L'ensemble de ces résultats fournissent les bases bioanalytiques solides pour la poursuite de la caractérisation structurale des enzymes HSulfs, visant à comprendre le rôle des MPTs, à élucider l'organisation des deux chaînes de HSulf-2, et à en déchiffrer leur rôle dans la liaison au substrat et dans la formation de la poche catalytique afin de développer un inhibiteur spécifique des HSulfs. / The human 6-O-endosulfatases HSulf-1 and -2 (HSulfs) catalyze the regio-selective hydrolysis of the 6-O-sulfate group of glucosamine residues within sulfated domains of heparan sulfate (HS), thereby ensuring a unique and original post-biosynthetic modification of the cell surface proteoglycans. Through their activity, the HSulfs enzymes modulate the interaction properties of HS and they are thus involved in crucial physiological processes as well as in pathological conditions, particularly in cancer. Therefore, HSulf-2 is considered as a valuable therapeutic target in cancer research. There is no crystallographic structure available for HSulfs so that their structural organization in two chains remains poorly understood. In this study, we report the first characterization by mass spectrometry (MS) of HSulf-2. An average molecular weight of 133115 g.mol-1 was determined for the whole enzyme by MALDI-TOF MS, i.e. higher than the naked amino acid backbone (98170 g.mol-1), highlighting a significant contribution of post-translational modifications (PTMs). The HSulf-2 protein sequence was determined by nano-LC-MS/MS, revealing four glycosylated sites at Asn 108, 147, 174 and 217. Besides, a unique O-glycosylation has been evidenced. By combining electrophoresis methods (SDS-PAGE / C-PAGE) and MS analysis (MALDI-TOF / HILIC-ESI-MS), we have identified this PTM as a glycosaminoglycan (GAG) of chondroitin sulfate/dermatan sulfate type. The MALDI-TOF analysis of the HSulf-2 modified form in which the two GAG binding sites have been impaired indicated a contribution of 34964 g.mol-1 for the whole PTMs, including 24727 g.mol-1 for the GAG chain only. This GAG chain is covalently linked to the HD domain within the C-terminus of HSulf-2. It is an unprecedented post-translational modification of an enzyme, providing the first example of a catalytic proteoglycan. N-glycans dispatched on both HSulf-2 long (N-terminus) and short (C-terminus) chains account for the remaining PTMs mass contribution 10237 g.mol-1. Overall, these results provide a bioanalytical platform for further structural investigations of the HSulf enzymes, aiming at deciphering the role PTMs and of each chain in the substrate binding and specificities and in the catalytic activities, and for the discovery of specific HSulfs inhibitors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018SACLE031 |
| Date | 31 August 2018 |
| Creators | Seffouh, Ilham |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Daniel, Régis |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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