Η πρωτεΐνη Tip60 (Tat-interactive protein, 60 kDa) είναι μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών MYST και αρχικά προσδιορίστηκε ως αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη με την HIV-1 ΤΑΤ πρωτεΐνη. Πολλά από τα μέλη της οικογένειας MYST μεταξύ αυτών και η Tip60, δρουν ως ακετυλοτρανσφεράσες ιστονών, γεγονός που υποδηλώνει πιθανούς ρόλους στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στην γονιδιακή ρύθμιση. Στη παρούσα διπλωματική, στόχος ήταν η μελέτη του προφίλ έκφρασης της ακετυλοτρανσφεράσης Τip60 σε πληθυσμούς Τ βοηθητικών παρθενικών (CD3+CD4+CD45RA+) και Τ βοηθητικών μνημονικών (CD3+CD4+CD45RO+) λεμφοκυττάρων καθώς και η δράση της στην μεταγραφή του HIV-1 και της IL-2.
Οι λόγοι που μας οδήγησαν στην μελέτη της Τip60 προκύπτουν από πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, που δείχνουν ότι υπάρχει μια πιθανή αλληλεπίδραση της Tip60 με τον παράγοντα Εts-2, ο οποίος συμμετέχει στη ρύθμιση της μεταγραφής τόσο του γονιδίου της IL-2 όσο και του HIV-1. Επιπλέον η IL-2 και ο HIV-1 παρουσιάζουν κοινή μεταγραφική ρύθμιση που ελέγχεται από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων σε κοινά cis στοιχεία. Επίσης, η Tip60 είναι μια Τat-αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο Tat του HIV-1. Τέλος το γεγονός ότι ο HIV-1 παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση στα εν ηρεμία Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα καθώς και ότι ο παράγοντας Εts-2, που πιθανόν αλληλεπιδρά με την Tip60, συμμετέχει στη καταστολή της έκφρασης του ιού, υποδηλώνει μια πιθανή συμμετοχή της Tip60 σε αυτή τη διαδικασία.
Αρχικά ελέγξαμε την έκφραση της Tip60 σε υποπληθυσμούς μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs). Η υψηλότερη έκφραση παρατηρήθηκε στα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (CD4+). Για να εξακριβώσουμε το αν και πώς εκφράζεται στους υποπληθυσμούς των Τ λεμφοκυττάρων, απομονώσαμε Τ βοηθητικά μνημονικά λεμφοκύτταρα (CD3+CD4+CD45RO+) από ολικό αίμα ενηλίκων και Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα (CD3+CD4+CD45RA+) από αίμα νεογνών (ομφαλίου λώρου). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε συνθήκες μη ενεργοποίησης η Τip60 εκφράζεται περισσότερο στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα (στα οποία η έκφραση του παράγοντα παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη). Μετά από την ενεργοποίηση των κυττάρων με PMA/IONO (P/I) η έκφραση της Tip60 αυξάνεται σημαντικά στα μνημονικά Th λεμφοκύτταρα ενώ στα παρθενικά Th παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη. Για να εντοπίσουμε μια λευχαιμική κυτταρική σειρά κατάλληλη για να χρησιμοποιηθεί για πειράματα διαμολύνσεων και ανοσοφθορισμού, ελέγξαμε την έκφραση της Tip60 σε εννέα λευχαιμικές κυτταρικές σειρές και είδαμε ότι η Τ λεμφοκυτταρική λευχαιμική σειρά Jurkat παρουσίαζε την υψηλότερη έκφραση της Τip60.
Η κυτταρική σειρά Jurkat παρουσιάζει επίσης παρόμοιο μοτίβο έκφρασης σε επίπεδο mRNA με τα Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα. Την έκφραση της Tip60 την ελέγξαμε και σε πρωτεϊνικό επίπεδο με τη μέθοδο Western blot σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα που απομονώσαμε από κύτταρα Jurkat. Για να ελέγξουμε τον εντοπισμό της Τip60 στα Jurkat, προχωρήσαμε σε πειράματα ανοσοφθορισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι σε συνθήκες μη ενεργοποίησης (CM) και ύστερα από ενεργοποίηση των κυττάρων (P/I) η Τip60 εντοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων Jurkat. Επίσης η ποσότητα της πρωτεΐνης Τip60 δεν αλλάζει ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα, αποτέλεσμα που συμφωνεί με τα πειράματα Western blot.
Προκειμένου να ελέγξουμε τη δράση της Τip60 στη μεταγραφική δραστηριότητα του HIV-1 και της IL-2 προχωρήσαμε σε πειράματα διαμόλυνσης Jurkat κυττάρων. Αρχικά διαμολύναμε τα κύτταρα με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου υπερέκφρασης της Τip60 (pCMX-tip60) και ελέγξαμε την έκφραση της IL-2 σε μεταγραφικό επίπεδο. Παρατηρήθηκε ότι αυξανομένης της ποσότητας του pCMX-tip60, αυξανόταν και η έκφραση του IL-2 mRNA. Μέσω πειραμάτων CAT-assays σε κύτταρα Jurkat, τα οποία συνδιαμολύναμε με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου pCMX-tip60 και πλασμιδίου αναφοράς CAT, που βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του HIV-1-LTR, διαπιστώσαμε ότι η υπερέκφραση της Τip60 αυξάνει και τη μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή του HIV-1.
Προκειμένου να διαπιστώσουμε εάν η Tip60 δρα απευθείας στον υποκινητή του HIV-1 και της IL-2 μέσω της πρόσδεσής της σε αυτόν είτε άμεσα, είτε έμμεσα μέσω συμπλόκου με άλλες πρωτεΐνες, προχωρήσαμε σε πειράματα ανοσοκρατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP assays) του υποκινητή της IL-2. Παράλληλα επειδή δεν υπάρχει γνωστή θέση πρόσδεσης της Tip60 απευθείας στην LTR αλληλουχία του HIV-1 και στον υποκινητή της IL-2 αναζητήσαμε την πρωτεΐνη με την οποία θα μπορούσε να αλληλεπιδρά προκειμένου να προσδεθεί στα παραπάνω. Με πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης διαπιστώσαμε ότι υπάρχει αλληλεπίδραση ανάμεσα στην Tip60 και στον παράγοντα Ets-2, ο οποίος προσδένεται άμεσα στην LTR αλληλουχία του HIV-1 και στον υποκινητή της IL-2 και έτσι επαληθεύσαμε τις αρχικές υποθέσεις για την αλληλεπίδραση τους.
Τα πειράματα που πραγματοποιήσαμε μας οδήγησαν στα παρακάτω συμπεράσματα: Υπάρχει διαφορική έκφραση της Tip60 ανάμεσα στα Τ βοηθητικά παρθενικά και μνημονικά λεμφοκύτταρα, αφού σε συνθήκες μη ενεργοποίησης (CM) η έκφραση της Tip60 είναι μεγαλύτερη στα μνημονικά σε σχέση με τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Η ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα προκαλεί επαγωγή της έκφρασης της Tip60 στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα, ενώ στα παρθενικά δεν προκαλεί καμία ουσιαστική αλλαγή. Η πρωτεΐνη Tip60 δρα σαν συνενεργοποιητής της μεταγραφής του ιού HIV-1 και της IL-2 μιας και προκαλεί επαγωγή στην μεταγραφική τους δραστηριότητα. Η πρωτεΐνη Tip60 αλληλεπιδρά in vivo με τον παράγοντα Εts-2 και παρουσιάζει το ίδιο πρότυπο πρόσδεσης με αυτόν, στον υποκινητή της IL-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat. / Tip60 (Tat-interactive protein, 60 kDa) is a member of the MYST protein family and was initially identified as an interacting protein with the HIV-1 TAT protein. Several members of MYST family, Tip60 among them, act as histone acetyltransferases, suggesting their possible roles in chromatin remodeling and gene regulation.
We chose to study Tip60 because it is a Tat-interactive protein and Tat is encoded by the Tat gene of HIV-1. Recent results from our laboratory suggest that there is a possible interaction between Tip60 and Εts-2 proteins, which is involved in the regulation of the transcription of both IL-2 and HIV-1. In addition, the transcription of IL-2 and HIV-1 is regulated by common transcription factors that act through binding to common cis-trans elements. We also know that the HIV-1 virus is transcriptionally active in activated CD4 T cells, and inactive in naïve CD4 T cells and that HIV-1 expression is blocked in naive Th cells by the transcriptional factor Ets-2. So the possible interaction between Tip60 and Εts-2 protein led us to study the Tip60 protein.
The main purpose of this study was to determine the expression profile of Tip60 acetyltransferase in naive T helper (CD3+CD4+CD45RA+) and memory T helper (CD3+CD4+CD45RO+) lymphocytes and its effect on the transcription of HIV-1 and IL-2 (due to their common transcriptional regulation in T helper cells).
The expression of Tip60 mRNA was measured in subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the highest levels were observed in Th lymphocytes. We therefore isolated from human peripheral blood and cord blood, CD3+CD4+CD45RO+ and CD3+CD4+CD45RA+ Th lymphocytes and we examined the expression of Tip60 at the transcriptional level by RT-PCR. The results showed that Tip60 mRNA expression levels were higher in CD3+CD4+CD45RO+ compared to CD3+CD4+CD45RA+ Th cells. Following cell activation with PMA/IONO (P/I), the transcriptional expression of Tip60 was increased in memory Th cells, whereas it remained unchanged in naive Th cells.
To identify a suitable cell line for transfection and immunofluorescence experiments, we measured Tip60 expression in nine cell lines and we observed that the T lymphocytic leukemia Jurkat presented the highest expression of Tip60 mRNA. Jurkat cells also presented a similar pattern of Tip60 mRNA expression levels with naïve Th lymphocytes.
In addition to determine the localization of Tip60 into the cells, we proceeded in immunofluorescence experiments. As a result, we observed that when cells were cultured in CM media +/- P/I, Tip60 was identified in the nucleus of Jurkat cells. The amount of Tip60 protein remained unchanged after cell activation (which was also determined by Western blot experiments).
To study the effect of Tip60 in transcription of HIV-1 and IL-2 we transfected Jurkat cells with increasing amounts of a Tip60 overexpressing vector (pCMX-tip60) and measured the expression of IL-2 and HIV-1 at the transcriptional level. Overexpression of Tip60, induced the transcription of IL-2 and also increased the transcriptional activity of HIV-1. Co-transfection experiments in Jurkat cells with increasing amounts of PCMX-tip60, led to a gradual increase of HIV1-LTR-CAT
Finally, we studied if Tip60 acts directly on the promoter of HIV-1 and IL-2 exercising its effect directly or through complexing with other proteins. According to the literature there is no Tip60 binding site in the promoter of HIV-1 and IL-2, so we searched for a protein that could interact with Tip60. We performed co-immunoprecipitation experiments that showed that there was an interaction between Tip60 and Ets-2, a factor that binds directly both on the LTR of HIV-1 and the IL-2 promoter.
In this work we suggest that Tip60 is expressed differentially in naïve and memory helper T cells and participates in the transcriptional activation of both HIV-1 LTR and IL-2. Also Tip60 protein interacts in vivo with Ets-2 protein and Tip60 binding activity is similar with Ets-2 binding activity to the ARRE-2 element of the IL-2 promoter in Jurkat cell line.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/8699 |
| Date | 13 February 2015 |
| Creators | Αγγελετοπούλου, Ιωάννα |
| Contributors | Μουζάκη, Αθανασία, Aggeletopoulou, Ioanna, Γώγος, Χαράλαμπος, Πάνος, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 6 |
Page generated in 0.0023 seconds