Muitos genes têm sido indicados como responsivos ao estresse genotóxico, mas devido à necessidade de validação, a busca por marcadores gênicos continua. Vários genes são relacionados ao sistema ubiquitina-proteassomo (UPS), o qual é responsável pela remoção seletiva de proteínas, sendo que falhas no UPS têm sido relacionadas a doenças neurodegenerativas e ao câncer. Assim, o presente trabalho teve como objetivo a busca e confirmação de marcadores gênicos de resposta ao estresse genotóxico, por meio do estudo da expressão transcricional e protéica dos genes ERN1, EIF2AK3, GADD153 e TRAF2, visando à confirmação das respostas em linhagens de fibroblastos (GM07492A e AS405) e de glioblastoma (U87MG), sob tratamentos com peróxido de hidrogênio (H2O2) e Bleomicina (Blm). Foram utilizados o Ensaio Cometa, a análise de expressão gênica transcricional por qPCR em tempo real e de expressão gênica ao nível protéico (imunofluorescência). Os resultados mostraram que os tratamentos empregados foram capazes de induzir danos no DNA, sendo que a sensibilidade ao tratamento e a capacidade de recuperação das linhagens foi variável dependendo do agente testado. A análise de expressão gênica mostrou que GM07492A apresentou indução dos genes ERN1 e GADD153 após tratamento com H2O2 (resposta precoce, zero e 2 h) e Blm (durante todo pós-tratamento). A linhagem AS405 exibiu indução de ERN1 e GADD153 para H2O2, enquanto que para Blm foram induzidos os genes EIF2AK3 e GADD153. Para U87MG, a indução de EIF2AK3 pelo H2O2 ocorreu de modo tardio, enquanto GADD153 mostrou-se induzido após ambos os tratamentos. A proteína ERN1 apresentou expressão discreta e pontual, inclusive nos pontos onde não houve indução transcricional, indicando uma expressão basal. Essa proteína se expressou em GM07492A no tratamento com Blm em zero hora, diferentemente de AS405. Para U87MG tratada com H2O2 observou-se discreta expressão de ERN1, sendo mais evidente para Blm. Quanto à proteína GADD153, esta foi expressa em fibroblastos nos vários tempos analisados. No entanto, U87MG mostrou expressão nuclear apenas nas células tratadas, sendo mais evidente para H2O2 comparativamente à Blm. Assim, as alterações observadas nos perfis de expressão gênica são compatíveis com a indução de danos no DNA, indicando o envolvimento de genes do UPS nas respostas celulares ao estresse genotóxico. Em conjunto, os resultados estimulam uma avaliação mais detalhada desses genes como marcadores de resposta ao estresse e evidencia a sua importância no cenário da via UPS. / Many genes have been reported as responsive to genotoxic stress, but due to the need of validation, the search for genetic markers still continues. Several genes are related to the ubiquitin-proteasome system (UPS), which is responsible for the selective removal of proteins, and UPS failures have been associated to neurodegenerative diseases and cancer. Thus, this study aimed the search and confirmation of genetic markers that were responsive to genotoxic stress. For this, we evaluated the transcriptional or protein expression of the genes ERN1, EIF2AK3, GADD153 and TRAF2, seeking confirmation of responses in fibroblast cell lines (GM07492A and AS405) and glioblastoma (U87MG) under treatment with hydrogen peroxide (H2O2) and bleomycin (BLM). We used the Comet Assay, the transcriptional analysis of gene expression by quantitative real-time PCR and protein expression byimmunofluorescence. The results showed that the treatments employed were able to induce DNA damage, and that cell sensitivity to treatments and recovery capability of cell lines varied according to the tested agent. The gene expression analysis showed that GM07492A presented induction of ERN1 and GADD153 genes after treatment with H2O2 (early response, zero and 2 h) and Blm (throughout the post-treatment). The cell line AS405 showed induction of GADD153 and ERN1 after H2O2, whereas with Blm the genes induced were EIF2AK3 and GADD153. For U87MG, the induction of EIF2AK3 by H2O2 occurred at a later stage, while GADD153 was promptly induced after both treatments. The protein ERN1 showed discreet and punctual expression, even at time point without transcriptional induction, indicating a basal expression. This protein was expressed in GM07492A by treatment with Blm at zero hour, differently of AS405. For U87MG treated with H2O2, ERN1 showed a slight expression, being more evident for Blm. Regarding GADD153, protein expression was observed in fibroblasts at all time point. However, U87MG showed nuclear expression only in cells treated with H2O2, being more evident that in BLM-treated cells. Thus, the observed changes in gene expression profiles are consistent with the induction of DNA damage, which indicates the participation of UPS genes in cellular responses to genotoxic stress. Together, the results encourage further evaluation of these genes as markers of stress response, demonstrating its importance in the UPS acting scope.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26092011-114734 |
| Date | 24 August 2011 |
| Creators | Berardinelli, Gustavo Nóriz |
| Contributors | Hojo, Elza Tiemi Sakamoto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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