Toll-Like Rezeptoren (TLR) erkennen Motive von diversen Komponenten (Proteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren) von Mikroorganismen, Viren und wirtseigenen Zellen, die als Agonisten eine Signalkaskade induzieren. Diese Agonisten werden als PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns), MAMPs (Microbe-Associated Molecular Patterns) oder DAMPs (Damage-Associated Molecular Patterns) bezeichnet. Werden TLRs stimuliert, kommt es zur Aktivierung von Signalkaskaden, die in einer agonistenspezifischen Freisetzung charakteristischer Muster von proinflammatorischen und antiinflammatorischen Zytokinen münden. Infektionserreger haben unterschiedliche Strategien entwickelt, um mittels Pathogenitätsfaktoren die Erkennung durch Immunzellen und damit der Wirtsimmunantwort zu umgehen. Yersinien, Salmonellen und Shigellen injizieren über Typ 3 Sekretionssysteme (T3SS) Effektorproteine in Wirtszellen und modifizieren die Aktivität von Rho GTPasen. Bisher wurden diese T3SS-Effektoren hinsichtlich Phagozytoseaktivierung bzw. -inhibition untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Frage untersucht, welche Rolle die Rho GTPasen von primären murinen Makrophagen für die TLR-Signalkaskade und Zytokinantwort haben könnten. Für diesen Zweck wurden erstmalig M-CSF differenzierte Knochenmarkmakrophagen (M-MΦ) sowie GM-CSF differenzierte Knochenmarkmakrophagen (GM MΦ) mit gendeletierten Rho GTPasen Rac1, RhoA, Rac1/RhoA sowie Cdc42 auf ihre Zytokinantwort nach PAMP (LPS, Pam3CSK4 und CpG) -Stimulierung untersucht. Für die konditionale Gendeletion wurden Mäuse mit „gefloxten“ Rho GTPase-Genen mit LysMCre Mäusen zur zellspezifischen Gendeletion gekreuzt. Die Aktivität des LysM-Promotors wurde in M-MΦ und GM-MΦ aus LysM-eGFP knockin Mäusen überprüft. Dabei wurde nachgewiesen, dass eine LysMCre abhängige Gendeletion mit nachfolgender Depletion von Rho GTPasen sowohl in M-MΦ als auch in GM-MΦ mit sehr hoher Effizienz entsteht. Interessanterweise zeigten GM-MΦ, die in der Literatur auch als DCs bezeichnet und damit keinen aktiven LysM Promotor haben sollten (Clarke and Gordon, 1998), ein starkes LysM-eGFP Signal und wiesen auch Rho GTPase-Gendeletionen auf. Bei den GM-MΦ handelt es sich wahrscheinlich um eine Mischpopulation unterschiedlich differenzierter MΦ-Subpopulationen, die keine klare PAMP/TLR-Signalantwort erwarten lassen. Neben der Verwendung von primären Knochenmarkzellen sollte geprüft werden, ob HoxB8 immortalisierte Knochenmarkzellen (Wang et al., 2006) von konditionalen Rho GTPase-knockout Mäusen ebenso für die TLR Fragestellung verwendet werden können. Das Wachstumsverhalten sowie die Oberflächenmarker der immortalisierten GM-iMΦ ähneln dem der primären GM-MΦ (Rosas et al., 2011), jedoch nicht das Zytokinsekretionsmuster nach TLR-Stimulierung. Da auch die immortalisierten GM-iMΦ heterogene Populationen bilden, wurde auf eine weitere Analyse hinsichtlich der PAMP-Zytokinantwort verzichtet und die Analyse auf primäre M-MΦ fokussiert. In M MΦ(Rac1-/-) und M-MΦ(RhoA-/-) konnten eindeutige Unterschiede zu M-MΦ (wt) und damit eine wichtige Rolle der Rho GTPasen bei der TLR-Signalkaskade und Zytokinantwort in M-MΦ nachgewiesen werden. Die 6 h-Stimulierung mit den spezifischen TLR2-, TLR4- bzw. TLR9-Agonisten Pam3CSK4, LPS bzw. CpG führte in M-MΦ(Rac1-/-) zu verstärkter IL-10 Sekretion (exkl. TLR2), in M MΦ(RhoA-/-) dagegen zu verstärkter IL-12 Sekretion. Nach 24 h-Stimulierung mit den verschiedenen TLR-Agonisten sind die Zytokinmuster für die M-MΦ(wt) und Rho GTPase-deletierten M-MΦ ähnlich (exkl. für IL-10 nach TLR2- und TLR9-Stimulierung). Yersinien injizieren mittels T3SS-Injektisome den Rac1-Inhibitor YopE (Rac-GAP) und den Rho GTPasen-Inhibitor YopT (proteolytische Spaltung des C-terminalen prenylierten Cystein-Membranankers, bevorzugt von RhoA), was zur Inhibition der Rho GTPasen der kontaktierten Phagozyten führt. Es wurden deshalb auch die Zytokinmuster nach TLR-Stimulierung von M-MΦ (Rac1-/-/RhoA-/-) bestimmt. Im Vergleich zu M-MΦ(wt) war die IL-12 Antwort praktisch unverändert, während die TNFα und die IL-6 Antwort der M-MΦ (Rac1-/-/RhoA-/-) erhöht waren. Mit diesen Ergebnissen der Rac1- und RhoA-abhängigen Freisetzung von proinflammatorischen und antiinflammatorischen Zytokinen durch M-MΦ können jetzt gezielte infektionsbiologische Untersuchungen z.B. mit Yersinien durchgeführt werden, um die pathogenetische Bedeutung der mikrobiellen Modulation der Rho GTPasen auf die Wirtsabwehr bzw. Zytokinantwort zu analysieren.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-osnabrueck.de/oai:repositorium.ub.uni-osnabrueck.de:urn:nbn:de:gbv:700-2014112412949 |
| Date | 24 November 2014 |
| Creators | Schulz, Anette |
| Contributors | Prof. Dr. Michael Hensel, Prof. Dr. Dr. Jürgen Heesemann |
| Source Sets | Universität Osnabrück |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/zip |
| Rights | Namensnennung-NichtKommerziell-KeineBearbeitung 3.0 Unported, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ |
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