Objetivos. 1. Caracterización de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) a lo largo de su ciclo de vida. 2. Caracterización de la línea de pez cebra deficiente en la subunidad catalítica de la telomerasa (tert). 3. Estudio de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) durante el proceso de regeneración de la aleta caudal del pez cebra salvaje y del pez cebra tert-deficiente. - Metodología. Para el primer objetivo, se han utilizado peces cebra de tipo salvaje, de diferentes estirpes y edades. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, el estudio de la actividad telomerasa mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica. La longitud telomérica se ha cuantificado por técnicas diferentes: TRF que consiste en una hibridación con una sonda telomérica radioactiva, Q-FISH y Flow-FISH que consisten en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. Para el cumplimiento del segundo objetivo, se han utilizado los genotipos, tert+/+, tert+/- y tert-/-. Además de las técnicas antes citadas, se han realizado curvas de supervivencia y un estudio histológico sobre diferentes tejidos (Hematoxilina/Eosina, PAS y TUNEL). El estudio de la G2 mutante se ha llevado a cabo con curvas de supervivencia, ensayo de apoptosis por TUNEL, y Q-FISH en núcleos metafásicos. Para el tercer objetivo, con los mismos genotipos y a diferentes edades. Se ha realizado un ensayo de detección de los círculos de ADN telomérico, un ensayo de regeneración en adultos con inhibición de un gen utilizando un morfolino seguido de electroporación o en larvas con inhibición de un gen por inmersión. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Los resultados de esta tesis han demostrado la estrecha relación de la expresión de la telomerasa y la longitud de los telómeros durante la vida del pez, concluyendo que estos dos parámetros pueden ser utilizados como biomarcadores de envejecimiento en el pez cebra. La línea de pez cebra deficiente en telomerasa ha mostrado signos de envejecimiento prematuro, como curvatura de la columna, infertilidad y reducción de la vida media de la G1, apoyando al pez cebra como un modelo prometedor para estudiar el envejecimiento inducido por el telómero. Además, la G1 muestra activación de p53 en respuesta al desgaste telomerico, reproduce el fenómeno de anticipación genética, ligado al acortamiento telomérico observado en humanos con DC, debido a haploinsuficiencia de la telomerasa. La G2 muere en las primeras etapas de desarrollo y la restauración de la actividad telomerasa rescata la longitud de los telómeros y la supervivencia, indicando que la dosis de telomerasa es crucial. La inhibición genética de p53 rescata los efectos adversos de la perdidad de telómeros, indicando que los mecanismos moleculares están conservados desde peces hasta mamíferos. El estudio de regeneración demuestra que los genotipos tert+/+ y tert-/- regeneran después de una o varias escisiones, aunque la eficiencia de regeneración disminuye con el envejecimiento en ambos. La línea tert-/- regenera con un ratio de regeneración menor que tert+/+, y mantiene la longitud telomérica. ALT está implicado en el mantenimiento de los telómeros durante la regeneración de la aleta caudal en el pez mutante, y se necesitan más estudios para determinar el papel de la telomerasa y posiblemente de ALT en el pez cebra salvaje durante este proceso. / Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Characterization of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) throughout its life cycle. 2. Characterization of the tert-deficient zebrafish line. 3. Study of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) during the caudal fin regeneration process in wild-type and tert mutant - Methodology. For approaching the first goal, wild-type zebrafish from different strains and different ages have been used. The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence called Q-TRAP, and also analyzed quantitatively by TRAP. The telomere length was quantified using three different techniques: by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH and Flow-FISH) or by hybridization using a radioactive telomeric probe (TRF assay). To address the second goal, three zebrafish genotypes: tert+/+, tert+/- y tert-/- have been used. Besides the above techniques, survival curves to estimate the mean lifespan of the first generation (G1) of tert mutant line, and a histological study of different tissues (Hematoxylin / Eosin, PAS and TUNEL staining) have been performed. To study the tert mutant line G2: survival curves, apoptosis by TUNEL assay, and Q-FISH on metaphasic nucleus. To achieve the third objective, we have used all three genotypes at different ages. Telomere length was analyzed by Flow-FISH, and the detection of telomeric DNA circles by CCassay. A caudal fin regeneration assay on adult with gene inhibition using morpholino following by electroporation was performed and finally a caudal fin regeneration assay on larvae with gene inhibition by immersion. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. The results of this tesis have shown that the expression of telomerase and telomere length are closely related during the entire life cycle of the fish and that these two parameters can be used as biomarkers of aging in zebrafish. Telomerase-deficient zebrafish characterization have shown premature aging and reduced lifespan in the first generation, as occurs in humans and may be considered as a promising model to study telomere-driven aging. Interestingly, this mutant line reproduced the genetic anticipation phenomenon, related to telomere shortening, observed in humans with DC. The second-generation embryos died in early developmental stages, and restoration of telomerase activity rescued telomere length and survival, indicating that telomerase dosage is crucial. Genetic inhibition of p53 rescued the adverse effects of telomere loss, indicating that the molecular mechanisms induced by telomere shortening are conserved from fish to mammals. The regeneration study showed that all genotypes regenerated after single or successive amputations and that regeneration efficiency decreased with aging. Tert mutant line showed a lower regeneration rate than its wild-type counterpart, and maintained telomere length in the regenerative tissue. ALT mechanism is implicated in telomere maintenance during caudal fin regeneration in telomerase-deficient fish. Further studies are necessary to definitively elucidate the role of telomerase and the possible ALT implication in telomere maintenance during caudal fin regeneration in wild-type animals.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UM/oai:www.tdx.cat:10803/374251 |
| Date | 05 February 2016 |
| Creators | Anchelin Flageul, Monique |
| Contributors | Cayuela Fuentes, Mª Luisa, Universidad de Murcia. Departamento de Biología Celular |
| Publisher | Universidad de Murcia |
| Source Sets | Universidad de Murcia |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 166 p., application/pdf |
| Source | TDR (Tesis Doctorales en Red) |
| Rights | ADVERTENCIA. El acceso a los contenidos de esta tesis doctoral y su utilización debe respetar los derechos de la persona autora. Puede ser utilizada para consulta o estudio personal, así como en actividades o materiales de investigación y docencia en los términos establecidos en el art. 32 del Texto Refundido de la Ley de Propiedad Intelectual (RDL 1/1996). Para otros usos se requiere la autorización previa y expresa de la persona autora. En cualquier caso, en la utilización de sus contenidos se deberá indicar de forma clara el nombre y apellidos de la persona autora y el título de la tesis doctoral. No se autoriza su reproducción u otras formas de explotación efectuadas con fines lucrativos ni su comunicación pública desde un sitio ajeno al servicio TDR. Tampoco se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al contenido de la tesis como a sus resúmenes e índices., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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