Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent la génération de toutes les lignées sanguines. Leur différenciation en cellules T matures se déroule dans un microenvironnement spécialisé, le thymus, orchestrée par des interactions complexes entre cytokines, chimiokines et cellules stromales. Les mutations bloquant la différenciation des cellules T ont un impact sur l'architecture du thymus, soulignant l’importance des interactions entre cellules T en développement et cellules stromales thymiques.Les déficits immunitaires combinés sévères sont généralement traités, avec succès, par transplantation de CSH allogénique par voie intraveineuse. Cependant, des complications peuvent survenir notamment en cas de greffe non compatible. Pour pallier à cela, la thérapie génique a été développée mais son efficacité et son innocuité restent à améliorer. Dans ce but, notre groupe a développé une approche par correction génique des progéniteurs T directement in vivo, via un vecteur lentiviral. Bien qu’efficace, là encore, l’efficacité de traitement reste insuffisante voire extrêmement limitée chez les macaques.Lors de ma thèse, j'ai donc évalué le potentiel de différents sérotypes de vecteur viraux adéno-associés (AAV) pour la transduction des thymocytes. L'administration IT de plusieurs sérotypes de AAV2 engendre une transduction des thymocytes >10 fois plus élevée que celle des vecteurs lentiviraux. Le sérotype AAV2/8 induit la transduction des thymocytes la plus efficace et les cellules transduites représentent jusqu'à 1% des cellules T périphériques d’une souris immunocompétente. En utilisant des souris immunodéficientes ZAP-70-/- comme paradigme, j'ai découvert que l'injection IT de l’AAV2/8-ZAP-70 entraîne une transduction et différentiation lymphocytaire T rapide, associée à la génération d’une medulla thymique. En effet, des cellules épithéliales thymiques de la médulla (mTEC) exprimant le régulateur auto-immun AIRE sont détectées en <2 semaines. Bien que cette reconstitution soit transitoire, les mTECs AIRE+ diminuant 10 semaines post-injection, les cellules T périphériques corrigées persistent >40 semaines et présentent environ 1 copie du vecteur AAV/cellule. Ces cellules T effectrices peuvent sécréter des niveaux élevés de cytokines et un nombre important de cellules T régulatrices est également généré. Ainsi, une seule vague de thymopoïèse à partir de progéniteurs transduits par l’AAV-ZAP-70, permet une restauration, rapide et transitoire de l'architecture thymique mais, à long terme de cellules T périphériques fonctionnelles.Pour évaluer les diverses populations de TEC régissant le développement et la sélection des cellules T, j'ai collaboré avec les groupes de P Jay/J Abramson/I Amit pour établir une cartographie de novo du compartiment stromal thymique. Nos analyses ont mis en évidence quatre populations majeures de mTEC (I-IV) avec des fonctions distinctes. Notamment, les mTEC-IV constituent une population unique présentant des similarités moléculaires et morphologiques avec les cellules tuft intestinales. Comme nous avions précédemment identifié la sécrétion d'IL-25 par les cellules tufts comme un régulateur des interactions entre compartiment épithélial et hématopoïétique dans l'intestin, nous avons évalué ce potentiel dans le thymus. Ainsi, des souris déficientes en cellules tuft intestinales présentent également une déficience spécifique en mTEC-IV et une homéostasie perturbée de diverses populations exprimant l'IL-25R dans le thymus. Notre recherche a donc permis d'identifier une nouvelle population de TEC tuft avec un rôle critique dans la formation de la niche immunitaire du thymus.L’ensemble de mes résultats montrent le potentiel thérapeutique de stratégie intrathymique de thérapie génique pour des patients ayant besoin d’une reconstitution rapide en cellules T et fournissent de nouvelles perspectives sur les populations stromales thymique et leur rôle dans l’équilibre de la niche immunitaire. / Hematopoietic stem cells (HSC) ensure the generation of all blood lineages. Their differentiation to mature T lymphocytes occurs in the specialized microenvironment of the thymus, orchestrated by complex interactions between cytokines, chemokines, and stromal cells. Mutations resulting in a block in T cell differentiation impact on the architecture of the thymus, pointing to the critical crosstalk between developing T cells and thymic stromal components.Genetic severe combined immunodeficiencies (SCID) are generally treated by the intravenous transplantation of healthy allogeneic HSCs. Although this therapy is often successful, complications can occur, especially for patients receiving non-histocompatible HSC transplants. To circumvent these problems , significant efforts have gone into developing gene therapy strategies but adverse events indicate the necessity of exploring other avenues. Our group hypothesized that in situ gene correction of T lymphoid progenitors in the thymus itself may overcome some of the drawbacks of ex vivo gene therapy. While intrathymic (IT) lentiviral vector administration corrected immunodeficient thymocyte precursors in mice, thymus transduction was inefficient and efficacy in macaques was limited.During my PhD, I assessed the in vivo potential of adeno-associated vectors (AAV) to transduce thymocyte precursors. Intrathymic administration of several different scAAV2 serotypes resulted in a >10-fold higher transduction of thymocytes (3-5%) as compared to lentiviral vectors. scAAV2/8 promoted the highest level of gene transfer and strikingly, transduced cells represented up to 1% of peripheral T lymphocytes in immunocompetent mice. Using ZAP-70-/- immunodeficient mice as a paradigm, I found that IT injection of an AAV2/8-ZAP-70 vector resulted in a rapid transduction and T cell differentiation, correlating with a dramatic generation of the thymus medulla. Indeed, medullary thymic epithelial cells (mTEC) expressing the AIRE autoimmune regulator were detected within <2 weeks. While this reconstitution was transient––AIRE+ mTECs decreased by 10 weeks post gene transfer––gene-corrected peripheral T cells, harboring approximately 1 AAV genome/ cell, persisted for >40 weeks. Effector T cells had the potential to secrete high levels of cytokines and significant numbers of gene-corrected regulatory T cells were also generated. Thus, a single wave of thymopoiesis, from intrathymic AAV-ZAP-70-transduced progenitors, allows for a rapid but transient restoration of the thymic architecture and long-term peripheral T cell function.To better assess the diverse TEC populations that orchestrate T cell development and selection, I collaborated with the groups of P. Jay/J. Abramson/I. Amit to combine single cell analysis and in-vivo fate-mapping to de novo characterize the entire stromal compartment of the thymus. Our analyses highlighted four major medullary TEC (mTEC I-IV) populations with distinct lineage regulator function and specifically, we found that mTEC-IV constitutes a highly divergent TEC subset that bears strong molecular and morphological characteristics to intestinal tuft cells. As we previously identified tuft cell secretion of IL-25 as a regulator of the crosstalk between the epithelial and hematopoietic compartments in the gut, we assessed the potential immune-modulatory function of mTEC-IV. Notably, mice deficient in intestinal tuft cells exhibited a specific depletion of mTEC-IV and a perturbed homeostasis of various IL25-R-expressing populations in the thymus. Taken together, our data identify a new tuft TEC population critical for shaping the thymus immune niche.In conclusion, the data generated during my PhD advance the therapeutic potential of intrathymic-based vector strategies for the treatment of patients requiring a rapid T cell reconstitution and provide new insights into thymic stromal subsets that are critical for shaping the thymus immune niche.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018MONTT020 |
| Date | 14 September 2018 |
| Creators | Pouzolles, Marie |
| Contributors | Montpellier, Zimmermann, Valérie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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