The aim of the project was to identify positions and amino acids that contribute to improved structure and stability of bispecific ADAPT proteins. During the 20 weeks project period, different amino acid substitutions were analysed to evaluate the effect on the three-helical structure and stability of bispecific ADAPTs targeting human serum albumin (HSA) and tumor necrosis factor α (TNFα). Furthermore, the study also included identification of which amino acid substitutions that affect the simultaneous binding ability of the anti-TNFα ADAPT. The amino acids substitutions that demonstrated improved stability was further evaluated in two other bispecific ADAPT proteins targeting epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), in terms of structure and stability. The TNFα-targeting ADAPT variants was produced in Escherichia coli (E. coli), purified through affinity chromatography using a HSA-coupled matrix and was further analysed and evaluated using SDS-PAGE, circular dichrosim, size-exclusion chromatography and surface plasmon resonance to detect expression levels, yields, thermal stability, secondary structure, and simultaneous binding to TNFα and HSA. Furthermore, the production, purification and evaluation were redone with other bispecific ADAPTs targeting EpCAM, to be able to draw more general conclusions. The outcome showed which amino acids substitutions in the scaffold that improve the structure and stability of the TNFα- and EpCAM-binding ADAPT protein variants, respectively. Some of the ADAPT variants targeting TNFα showed improved stability and increased melting temperature. One of the variants with most potential from these mutants was ADAPT_TNFα5_F21K, both able to refold after heat treatment and demonstrated a higher melting temperature in the same order as the original binder. The variant bound HSA but not TNFα, thus consequently was not able to bind TNFα and HSA simultaneously. The variants ADAPT_TNFα5_V17I and ADAPT_TNFα5_M22Q both demonstrated a clear alpha-helix structure, were able to refold after heat treatment and demonstrated simultaneous binding to TNFα and HSA. The melting temperature for ADAPT_TNFα5_V17I was the same as for the original binder (59°C) and ADAPT_TNFα5_M22Q showed a decreased melting temperature (45°C) compared to the original binder. The amino acid substitutions that improve the stability of the original binder was combined and two variants withthese mutations were designed. Unfortunately, these variants could not express in E. coli cells and were not able to be produced. For the EpCAM targeting mutants one variant, ADAPT_EpCAM_02_X11N, showed huge improvements of the stability and structure compared to the original binder ADAPT_EpCAM_02. This variant improved the melting temperature with 24°C compared to the original binder and was able to refold after heat treatment, which the original binder did not have the ability to do. However, ADAPT_EpCAM_02_X11N was not able to simultaneously bind EpCAM and HSA, demonstrating that the mutation also had an effect on the binding ability. In the variant ADAPT_EpCAM_08 the mutation Y5I improved the melting temperature with 14°C compared to the original binder and was able to refold after thermal denaturation. However, the simultaneous binding to EpCAM and HSA was negatively affected. The project results have contributed to better understanding of the bispecific ADAPT proteins, which enables further development of the scaffold. The amino acid positions in the scaffold that showed to be important for ADAPT structure and stability will be used in the design of a new ADAPT-library, from which new binders with improved structure and stability hopefully can be selected, which might have the potentially to be used as future therapeutics. / Syftet med projektet var att identifiera positioner och aminosyror som bidrar till ökad struktur och stabilitet hos bispecifika ADAPT proteiner. Under projektperioden på 20 veckor har olika aminosyrasubstitutioner i ett bispecifikt TNFα/HSA-bindande ADAPT protein analyserats med syftet att undersöka om dessa substitutioner förbättrar stabiliteten och strukturen hos proteinet. Vidare analyserades hur dessa aminosyrasubstitutioner påverkar ADAPTs förmåga att binda HSA och TNFα samtidigt. De aminosyrasubstitutioner som visade på förbättrad stabilitet, utvärderades vidare med avseende på struktur, stabilitet och bindning i två andra bispecifika ADAPTs riktade mot EpCAM. De TNFα-bindande ADAPT-varianterna producerades i E. coli, renades fram med affinitetskromatografi med en HSA-kopplad matris, analyserades och utvärderades med metoder som SDS-PAGE, cirkulär dichroism, gelfiltrering och surface plasmon resonance för att detektera uttrycks-nivåer, utbyten, termisk stabilitet, sekundärstruktur och om proteinerna upprätthöll bindning till både HSA och TNFα. Vidare utvärderas de aminosyrasubstitutionerna som visade på förbättrad stabilitet även i andra bispecifika ADAPTs riktade mot EpCAM för att kunna dra mer generella slutsatser. Resultaten visade vilka aminosyrasubstitutioner i proteinet som förbättrade strukturen och stabiliteten hos de TNFa- respektive EpCAM-bindande ADAPT-protein varianterna. Några av ADAPT-TNFa varianterna visade förbättrad stabilitet och ökad smälttemperatur. ADAPT_TNFα5_F21K hade en tydlig alpha-helix struktur och kunde återveckas efter värmebehandling. Varianten hade en smälttemperatur i samma storleksordning som den ursprungliga TNFα-bindande ADAPT varianten. ADAPT_TNFα_F21K hade dock inte förmågan att binda simultant till TNFα och HSA. Varianterna ADAPT_TNFα_V17I och ADAPT_TNFα_M22Q visade en tydlig alpha-helix struktur, kunde återveckas efter värmebehandling och visade simultan bindning till TNFα och HSA. ADAPT_TNFα_V17I hade samma smälttemperatur som den ursprungliga bindaren (59°C) medan ADAPT_TNFα_M22Q visade en minskad smälttemperaturen (45°C) jämfört med original-bindaren. Två varianter bestående av kombinationer av de aminosyrasubstitutioner som visade på förbättrad stabilitet skapades. Dessa kunde tyvärr inte uttryckas och produceras i E.coli-celler. Gällande de EpCAM-bindande ADAPT-proteinerna var det en variant, ADAPT_EpCAM_02_X11N, som visade stor förbättring i stabilitet och struktur jämfört med originalbindaren ADAPT_EpCAM_02. Denna variant hade 24°C högre smälttemperatur jämfört med originalbindaren och kunde återveckas efter värmebehandling, vilket inte original-bindaren kunde. Dock kunde inte ADAPT_EpCAM_02_X11N binda simultant till EpCAM och HSA. Detta tyder på att denna mutation har en negativ effekt på ADAPTs bindingskapacitet. Varianten ADAPT_EpCAM_08_Y5I visade en förbättrad smälttemperatur på 14°C jämfört med original-bindaren ADAPT_EpCAM_08 och kunde återveckas efter värmebehandling. Dock resulterade även denna mutation i en negativ effekt på den simultana bindningen till EpCAM ochHSA. Projektets resultat har bidragit till en bättre förståelse av de bispecifika ADAPT-proteinerna och möjliggör en vidareutveckling av scaffoldet. Aminosyranspositionerna som visade sig vara viktiga för ADAPTs struktur och stabilitet kommer användas för design av ett ny ADAPT-bibliotek, från vilket nya bindare med förbättrad struktur och stabilitet förhoppningsvis kan bli selekterade. Dessa nya, förbättrade bindare, ökar de bispecifika ADAPT proteiners användningsmöjligheter inom terapi.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-309512 |
| Date | January 2021 |
| Creators | Eriksson, Ella |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2021:272 |
Page generated in 0.0034 seconds