Durante il secolo scorso sono state individuate alcune mutazioni per il
colore della buccia della varietà William che invece di essere giallo arriva a
maturazione con diverse tonalità di colore rosso. L’intensità e la tipologia del
fenotipo dovuto a questa mutazione mostra una variabilità all’interno dei
diversi cloni rossi di questa cultivar: Max Red Bartlett, Rosired e Sensation.
Questa mutazione è ereditabile e usando come genitore uno dei sopra-citati
mutanti per il rosso sono state prodotte altre cultivar caratterizzate da buccia
rossa come Cascade.
Max Red Bartlett presenta una intensa colorazione rossa nelle prime fasi di
maturazione per poi striarsi perdendo di lucentezza e non ricoprendo
totalmente la superficie del frutto. Max Red Bartlett ha inoltre il problema di
regressione del colore. Questa mutazione infatti non è stabile e dopo qualche
anno può regredire e presentare il fenotipo di William. Diverso è invece lo
sviluppo per esempio di Rosired che durante le prime fasi di accrescimento del
frutto è identica a Williams (di colore verde con la parte del frutto rivolta
verso il sole leggermente rossastra) per poi virare e mantenere un vivo colore
rosso su tutta la superficie del frutto. Questa tesi si è proposta di caratterizzare
questa mutazione che coinvolge in qualche modo la via biosintetica per la
sintesi del colore. In particolare si è cercato di investigare sui probabili geni
della via degli antociani coinvolti e in quale modo vengono espressi durante la
maturazione del frutto, inoltre si è cercato di trovare quali specifiche molecole
venissero diversamente sintetizzate. Le cultivar utilizzate sono state William e
Max Red Bartlett. Di quest’ultima era già disponibile una mappa molecolare,
ottenuta sulla popolazione di’incrocio di Abate Fetel (gialla) x MRB (rossa)
con AFLP e SSR, quest’ultimi hanno permesso di denominare i diversi linkage
group grazie alla sintenia con le altre mappe di pero e di melo.
I semenzali appartenenti a questa popolazione, oltre a dimostrare l’ereditarietà
del carattere, erano per il 50% gialli e 50% rossi. Questo ha permesso il
mappaggio di questo carattere/mutazione che si è posizionato nel linkage
group 4.
Una ricerca in banca dati eseguita in parallelo ha permesso di trovare sequenze
di melo dei geni coinvolti nella via biosintetica degli antociani (CHS, CHI,
F3H, DFR, ANS e UFGT), sulle quali è stato possibile disegnare primer
degenerati che amplificassero su DNA genomico di pero. Le amplificazioni
hanno dato frammenti di lunghezza diversa. Infatti nel caso di F3H e DFR
l’altissima omologia tra melo e pero ha permesso l’amplificazione quasi totale
del gene, negli altri casi invece è stato necessario utilizzare primer sempre più
vicini in modo da facilitare l’amplificazione. I frammenti ottenuti sono stati
clonati sequenziati per confermare la specificità degli amplificati.
Non sono stati evidenziati polimorfismi di sequenza in nessuna delle sei
sequenze tra William e Max Red Bartlett e nessun polimorfismo con Abate,
per questo motivo non è stato possibile mapparli e vedere se qualcuno di
questi geni era localizzato nella medesima posizione in cui era stato mappato il
“colore/mutazione”. Sulle le sequenze ottenute è stato possibile disegnare altri
primer, questa volta specifici, sia per analisi d’espressione.
Inizialmente è stato sintetizzato il cDNA dei geni suddetti per retrotrascrizione
da RNA estratto sia da bucce sia da foglie appena germogliate (le quali
presentano solo in questa fase una colorazione rossastra in MRB ma non in
William). Al fine di osservare come varia l’espressione dei geni della via
biosintetica delle antocianine durante la fase di maturazione dei frutti, sono
stati fatti 4 campionamenti, il primo a 45gg dalla piena fioritura, poi a 60, 90,
120 giorni. Foglie e bucce sono state prelevate in campo e poste
immediatamente in azoto liquido. Dai risultati con Real Time è emerso che vi
è una maggiore espressione nelle prime fasi di sviluppo in Max Red Bartlett
per poi calare enormemente in giugno. Si potrebbe ipotizzare che ci sia una
reazione di feed back da parte della piante considerando che in questa fase il
frutto non si accresce. I livelli di espressione poi aumentano verso la fase
finale della maturazione del frutto. In agosto, con l’ultimo campionamento vi è
una espressione assai maggiore in Max Red Bartlett per quei geni posti a valle
della via biosintetica per la sintesi delle antocianine. Questo risultato è
confermato anche dal livello di espressione che si riscontra nelle foglie. In cui
i geni F3H, LDOX e UFGT hanno un livello di espressione nettamente
maggiore in Max Red Bartlett rispetto a William.
Recentemente Takos et al (2006) hanno pubblicato uno studio su un gene
regolatore della famiglia Myb e ciò ha permesso di ampliare i nostri studi
anche su questo gene. L’altissima omologia di sequenza, anche a livello di
introni, non ha permesso di individuare polimorfismi tra le varietà Abate Fetel
e Max Red Bartlett, per nessun gene ad eccezione proprio del gene regolatore
Myb. I risultati ottenuti in questa tesi dimostrano che in pero l’espressione
relativa del gene Myb codificante per una proteina regolatrice mostra una netta
sovra-espressione nel primo stadio di maturazione del frutto, in Max Red
Bartlett 25 volte maggiore che in William. All’interno della sequenza del gene
un polimorfismo prodotto da un microsatellite ha permesso il mappaggio del
gene nel linkage group 9 in Max Red Bartlett e in Abate Fetel. Confrontando
questo dato di mappa con quello del carattere morfologico rosso, mappato nel
linkage group 4, si deduce che la mutazione non agisce direttamente sulla
sequenza di questo gene regolatore, benché sia espresso maggiormente in Max
Red Bartlett rispetto a William ma agisca in un altro modo ancora da scoprire.
Infine per entrambe le varietà (William e Max Red Bartlett) sono state
effettuate analisi fenotipiche in diversi step. Innanzi tutto si è proceduto con
una analisi preliminare in HPLC per osservare se vi fossero differenze nella
produzione di composti con assorbenza specifica delle antocianine e dei
flavonoidi in generale. Si è potuto quindi osservare la presenza di due picchi in
Max Red Bartlett ma non in William. La mancanza di standard che
coincidessero con i picchi rilevati dallo spettro non ha permesso in questa fase
di fare alcuna ipotesi riguardo alla loro natura.
Partendo da questo risultato l’investigazione è proceduta attraverso analisi di
spettrometria di massa associate ad una cromatografia liquida identificando
con una certa precisione due composti: la cianidina-3-0-glucoside e la
quercitina-3-o-glucoside. In particolare la cianidina sembra essere la molecola
responsabile della colorazione della buccia nei frutti di pero. Successive
analisi sono state fatte sempre con lo spettrometro di massa ma collegato ad un
gas cromatografo per verificare se vi fossero delle differenze anche nella
produzione di zuccheri e più in generale di molecole volatili. L’assenza di
variazioni significative ha dimostrato che la mutazione coinvolge solo il colore
della buccia e non le caratteristiche gustative e organolettiche di William che
restano inalterate nel mutante.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:unibo.it/oai:amsdottorato.cib.unibo.it:83 |
| Date | 21 May 2007 |
| Creators | Pierantoni, Luca <1978> |
| Contributors | Sansavini, Silviero |
| Publisher | Alma Mater Studiorum - Università di Bologna |
| Source Sets | Università di Bologna |
| Language | Italian |
| Detected Language | Italian |
| Type | Doctoral Thesis, PeerReviewed |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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