Tesis Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / El inflamasoma NLRP3 es un complejo multiproteico ampliamente estudiado en el sistema inmune. Las investigaciones realizadas se han centrado, especialmente en estos últimos años, en su participación en el inicio y desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles.
Este complejo se compone de tres proteínas diferentes: NLRP3 (receptor intracelular), ASC (proteína adaptadora) y caspasa-1 (enzima), y posee la peculiaridad de que su activación está comandada por dos diferentes señales. La primera señal corresponde a patrones moleculares asociados a daño (DAMPS) o a patógenos (PAMPS) que generan la activación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) ubicados en la membrana plasmática, como los receptores de tipo Toll (TLR). La activación de estos receptores, induce la síntesis de la citoquina blanco de caspasa-1: pro-IL-1β. La segunda señal son moléculas muy específicas que generan, indirectamente, la activación de NLRP3, lo que conlleva el reclutamiento de ASC y pro-caspasa-1 y la activación de caspasa-1, quedando esta enzima lista para escindir su blanco: pro-IL-1β a IL-1β. Una vez activada IL-1β, es secretada hacia el medio extracelular.
La activación del inflamasoma a nivel cardiaco es un hecho poco comprendido. Se ha establecido que los fibroblastos cardíacos (FC) serían las células que activarían su propio inflamasoma NLRP3 y secretarían IL-1β hacia el medio extracelular en modelos de daño cardiaco. No obstante, se desconocen señales propias del corazón que generen la activación del inflamasoma.
En este trabajo se plantea que Angiotensina II (Ang II) sería una señal 2 de activación del inflamasoma en FC. Este planteamiento surgió debido a que los FC presentan receptores de Ang II, los que activados llevan a un aumento citosólico de la concentración de Ca2+ (proveniente desde el retículo), evento que ha sido relacionado con la activación de NLRP3 en células inmunes. La hipótesis de este trabajo de tesis establece que Angiotensina II a través de la vía transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activa el inflamasoma NLRP3 en fibroblastos cardiacos, conduciendo a la escisión y secreción de IL-1β. Mientras que los objetivos se resumen en, investigar si las proteínas del inflamasoma NLRP3 y pro-IL-1β son expresadas en FC, estudiar si Ang II activa al inflamasoma NLRP3, a través de la cascada transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 y evaluar si Ang II induce la escisión y secreción de IL-1β hacia el medio extracelular.
A partir de cultivos primarios de FC de rata neonata, se estableció que los FC expresan los componentes del inflamasoma, y que éstos no son inducidos por lipopolisacárido (LPS) 1 μg/mL (señal 1). Asimismo, se determinó que pro-IL-1β presenta niveles basales muy bajos y que su expresión es inducida por LPS de manera tiempo dependiente.
Se realizaron tres metodologías distintas para demostrar que Ang II 1 μM activa el inflamasoma: 1) Por inmunocitoquímica se demostró que existe colocalización de NLRP3 y ASC al estimular los FC con Ang II; 2) Por cuantificación de la actividad de caspasa- 1, se demostró que Ang II estimula la actividad de caspasa-1 respecto de los controles y 3) Por cuantificación de la secreción de IL-1β por ELISA, se demostró que Ang II estimula la secreción de IL-1β hacia el medio extracelular.
Para dilucidar la cascada de señalización responsable de activar el inflamasoma, se intervino utilizando los inhibidores Losartán, U73122 y 2-APB, y el quelante de Ca2+ BAPTA-AM. A partir los resultados obtenidos se demostró que Ang II induce la activación de inflamasoma a través de la señalización comprendida por el receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1), fosfolipasa C (PLC), receptor de inositol trifosfato (IP3R) y Ca2+.
Adicionalmente, se demostró por silenciamiento génico de NLRP3 con siRNA y por el uso de un bloqueador irreversible de caspasa-1, YVAD, que el inflamasoma activado por Ang II sería el conformado por NLRP3 y caspasa-1.
Finalmente, se pudo demostrar que la secreción de IL-1β inducida por Ang II, sería a través de un mecanismo no clásico de secreción de proteínas, donde estaría involucrado el transporte vesicular.
Se concluyó que Ang II a través de la vía transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activaría el inflamasoma NLRP3 en FC, conduciendo a la secreción, por transporte vesicular, de IL-1β hacia el medio extracelular / The NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex studied extensively in the immune system. The research has been carried out, especially in recent years, in its participation in the initiation and development of chronic non-communicable diseases.
The NLRP3 inflammasome is consists of three different proteins: NLRP3 (intracellular receptor), ASC (adapter protein) and caspase-1 (enzyme), and has the peculiarity that its activation is commanded by two different signals. The first signal corresponds to damage associated molecular patterns (DAMPs) or pathogen (PAMPS) that generates the activation of pattern recognition receptor (PRR) located on the plasma membrane as Toll-like receptor (TLR). Activation of these receptors induces the synthesis of the target cytokine of caspase-1: pro- IL-1β. The second signals are very specific molecules that indirectly activate NLRP3, leading to the recruitment of ASC and pro-caspase-1 and activation of caspase-1, being this enzyme ready to cleave its target: pro-IL-β to IL-1β. Once activated IL-1β is secreted into the extracellular medium.
Inflammasome activation at cardiac level is a little understood fact. It has been established that cardiac fibroblasts (CF) would activate its NLRP3 inflammasome and secrete IL-1β into the extracellular environment in models of heart damage. However, own heart signals that generate activation inflammasome are unknown.
This study suggested that Ang II would be a signal 2 for the activation of the inflammasome in FC. This approach emerged because the CF express Ang II receptors, which lead to increase cytosolic Ca2 + concentration (coming from the reticle), a phenomenon that has been linked to the activation of NLRP3 in immune cells. The hypothesis of this thesis establishes that Angiotensin II through the signal transduction pathway AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activates the inflammasome NLRP3 in cardiac fibroblasts, leading to cleavage and secretion of IL-1β. While the objectives are summarized in, to investigate whether proteins inflammasome NLRP3 and pro-IL-1β are expressed in FC, to study whether Ang II activates the inflammasome NLRP3, through the signal transduction cascade AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 and to evaluate whether Ang II induces excision and secretion of IL-1β into the extracellular environment.
Previously, from primary cultures of neonatal rat CF, it was established that the CF express inflammasome components and that they are not induced by LPS (signal 1). It was also determined that pro-IL-1β has very low basal levels and that its expression is induced by LPS in a time-dependent manner.
Three different methodologies to demonstrate that Ang II activates the inflammasome were performed.1) Immunocytochemistry showed that NLRP3 and ASC colocalizate after stimulating CF with Ang II. 2) Quantitation of caspase-1 activity was demonstrated that Ang II induces an increase in caspase-1 activity compared to controls. 3) Finally, the secretion of IL-1β was quantified by ELISA, demonstrating that Ang II induced IL-1β secretion to the extracellular medium.
To elucidate the signaling pathway triggered by Ang II, the signaling was intervened using inhibitors: Losartan, U73122 and 2-APB; and the Ca2+ chelator BAPTA-AM. The results obtained demonstrated that Ang II induce the activation of the inflammasome through signaling conformed by the angiotensin II receptor type 1 (AT1), phospholipase C (PLC), inositol triphosphate receptor (IP 3 R) and Ca2+.
Additionally, silencing NLRP3 with siRNA and using an irreversible inhibitor of caspase-1 YVAD, the inflammasome activated by Ang II is the conformed by NLRP3 and caspase-1.
Finally, was demonstrated that the IL-1β secretion induced by Ang II, would be through a non-classical protein secretion mechanism, which would be involved the vesicular transport.
We conclude that Ang II through the signal transduction pathway AT1R / PLC / IP3R / Ca+2 activates the NLRP3 inflammasome in CF, leading to the secretion of IL-1β by vesicular transport to the extracellular medium / Conicyt; Fondap; Fondecyt / 2017
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/142351 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Boza Fuentes, Pía de los Angeles |
| Contributors | Díaz Araya, Guillermo, García Nannig, Lorena |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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