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Previous issue date: 2014-02-27 / O Circovírus Suíno (CVS) é um vírus de DNA fita simples, que pertence à família Circoviridae, com genoma de 1,7kilobases. Apresenta dois tipos principais, o CVS1 e o CVS2. O CVS1 não é patogênico, enquanto que o CVS2 está associado a um conjunto de doenças como a Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS). Estes tipos virais possuem a proteína Rep, essencial para replicação e a proteína Cap, formadora do capsídeo. A pCap possui epítopos imunoreativos e imunodominantes e tem sido utilizada como um antígeno tanto para o diagnóstico, quanto para aplicação vacinal, contra infecções causadas pelo CVS2. Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que utiliza metanol como única fonte de carbono e tem sido utilizada para expressar genes heterólogos por apresentar vantagens como, a realização de modificações pós-traducionais e sua fácil manipulação. Objetivou-se nesse estudo expressar o gene Cap códon-otimizado do CVS2 para expressar em Pichia pastoris, visando a produção secretória da pCap e sua aplicação como antígeno recombinante em imunoensaios. Para tanto, a construção pPICZαA/CVS2Capo obtida após clonagem gênica foi inserida no genoma da levedura por eletroporação e o sistema foi induzido com metanol, sob o controle do promotor AOX1, por 72h. Os clones expressos positivamente foram identificados em Colony blot e Dot blot, após a reação dos clones com anticorpo-antiHis. A rCap foi detectada com massa molecular de ~39 kDa em sobrenadante da P. pastoris por SDS-PAGE e Western blot. Neste último, a detecção foi feita pelo reconhecimento da rCap por anticorpos anti-CVS2 de soros de animais com histórico de SMDS. A rCap testada em ELISA indireto contra soros de animais sabidamente negativos e positivos, previamente determinados pela imunoperoxidase (IP), mostrou alta eficiência discriminatória com alta razão positivo/negativo de 597. Após análise preliminar de parâmetros concordantes e discordantes, entre o IP e ELISA, observou-se uma alta concordância entre eles. Os resultados representam a efetiva produção da rCap pela via secretória de P. pastoris, com sugestiva preservação dos epítopos imunoreativos na mesma. Isto demonstra a viabilidade do sistema eucarioto de expressão utilizado e o potencial uso da rCap para detecção de anticorpos anti-CVS2 como ferramenta auxiliar no diagnóstico de doenças causadas pelo CVS2 como a SMDS.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/12678 |
| Date | 27 February 2014 |
| Creators | ARAÚJO, Jackeline Gomes da Silva |
| Contributors | FREITAS, Antonio Carlos Dias de |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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