[EN] In vitro production (IVP) of embryos has multiple applications, including the development of
transgenic / genetically modified animals that are of broad utility in the biomedical field and could reach
to be so in agriculture. In this sense, the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with transfected sperm,
such as somatic cell nuclear transfer (SCNT) with transfected cells, have proved to be valid strategies to
generate animals with stably integrated exogenous DNA, capable of transmitting to their offspring.
However, to make it feasible the availability of a large number of IVP embryos it's necessary. Despite the
development of IVP systems of pig embryos for these strategies in the last decades, and a high variety of
protocols, there are still some critical issues that limit embryonic development and therefore its
application on a large scale.
The main objective of this thesis has then pursued, optimizing the ICSI and SCNT protocols in order
to improve the viability of IVP porcine embryos. The initial approach was to address the study both in
vitro maturation (IVM) and oocyte activation within the SCNT frame. To this end, the most efficient
electrical activation protocol under our working conditions was selected from among three proposals,
and we then studied the effect of serum supplement on IVM medium, noticing that it doesn't increase
the development of partenogenetic embryos produced by electrical activation nor of those produced by
SCNT.
Moreover, and in order to optimize the ICSI technique, different aspects such as Ca2+ concentration
in the microinjection medium, sperm pretreatment with Triton X-100 (TX) and the addition of cysteine
or caffeine supplements to the in vitro culture (IVC) medium post-ICSI, were studied in order to promote
sperm nucleus decondensation and oocyte activation. Noticing that: i) the concentration of Ca2+ did not
influence the cleavage rate, or the development of partenogenic embryos from microinjected oocytes
without sperm (sham injection); ii) caffeine did not increase either the pronuclear formation neither the
subsequent embryo development, in combination with TX sperm pre-treatment it reduced oocyte
activation and embryo development rates; iii) the pronuclear formation was not increased by the sperm
pre-treatment with TX nor by the cysteine treatment, regardless of the time of the study assessment. / [ES] La producción in vitro (PIV) de embriones goza de múltiples aplicaciones, entre las que cabe
destacar la obtención de animales transgénicos/modificados genéticamente que resultan de amplia
utilidad en el ámbito biomédico y podrían llegar a resultarlo en el agropecuario. En este sentido, tanto la
inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) con espermatozoides transfectados, como la
transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) con células transfectadas, han demostrado ser
estrategias válidas para generar animales con ADN exógeno integrado de manera estable, capaces de
transmitirlo a su descendencia. Sin embargo, para lograrlo es necesario disponer de un gran número de
embriones PIV. A pesar del desarrollo durante las últimas décadas de sistemas de PIV de embriones de
porcino para estas estrategias, y la disponibilidad de gran variedad de protocolos, persisten aún ciertos
puntos críticos que limitan el desarrollo embrionario y por lo tanto su aplicación a gran escala.
El objetivo principal de esta tesis ha perseguido por lo tanto, la optimización de los protocolos
de ICSI y SCNT con el fin de mejorar la viabilidad de los embriones PIV de porcino. El planteamiento
inicial consistió en abordar el estudio tanto de la maduración in vitro (MIV) como de la activación
oocitaria en el marco de la SCNT. Para ello se seleccionó de entre tres propuestas de activación artificial,
el protocolo de activación eléctrica (que resultó ser el más eficiente bajo nuestras condiciones de
trabajo), y se estudió a continuación el efecto del suplemento de suero en el medio de MIV,
constatando que no se incrementaba el desarrollo de embriones partenogenotas producidos mediante
activación eléctrica ni de aquellos producidos mediante SCNT.
Por otra parte, y con el fin de optimizar la técnica de ICSI se abordaron diferentes aspectos
como la concentración de Ca2+ en el medio de microinyección, el pre-tratamiento espermático con
Triton X-100 (TX), así como la adición de suplementos de cafeína o cisteína al medio de cultivo in vitro
(CIV) pos-ICSI, con el fin de favorecer la descondensación del núcleo espermático y la activación
oocitaria. Observando que: i) la concentración de Ca2+ no influyó en la tasa de división, ni en la de
desarrollo de embriones partenogenotas procedentes de oocitos microinyectados sin espermatozoide
(sham injection); ii) la cafeína no incrementó la formación pronuclear ni en el desarrollo embrionario
posterior, y en combinación con el pre-tratamiento espermático con TX redujo la activación oocitaria y
el desarrollo embrionario; iii) la formación pronuclear no se vio incrementada por el pre-tratamiento
espermático con TX ni por el tratamiento con cisteína, independientemente del momento de la
evaluación estudiado. / [CAT] La producció in vitro (PIV) d'embrions gaudeix de múltiples aplicacions, entre les quals cap
assenyalar l'obtenció d'animals transgènics/modificats genèticament que resulten d'àmplia utilitat en el
àmbit biomèdic y podrien arribar a ser-ho en el àmbit agropecuari. En aquest sentit, tant la injecció
intracitoplasmàtica d'espermatozoïds (ICSI) amb espermatozoïds transfectats, com la transferència
nuclear de cèl.lules somàtiques (SCNT) amb cèl.lules transfectades, han demostrat ser estratègies
vàlides per a l'obtenció d'animals amb ADN exogen integrat de manera estable, capaços de transmetrela
a la seva descendència. No obstant això, per aconseguir-ho és necessari disposar d'un gran nombre
d'embrions PIV. Malgrat el desenvolupament durant les últimes dècades de sistemes de PIV d'embrions
de porcí per a aquestes estratègies, i la disponibilitat de gran varietat de protocols, persisteixen encara
certs punts crítics que limiten el desenvolupament embrionari i per tant la seva aplicació a gran escala.
L'objectiu principal d'aquesta tesi ha perseguit per tant, l'optimització dels protocols d' ICSI i SCNT
per tal de millorar la viabilitat dels embrions PIV de porcí. El plantejament inicial va consistir en abordar
l'estudi tant de la maduració in vitro (MIV) com de l'activació oocitària en el marc de la SCNT. Per a això
es va seleccionar entre tres propostes d'activació artificial, el protocol d'activació elèctrica (que va
resultar ser el més eficient sota les nostres condicions de treball), i es va estudiar a continuació l'efecte
del suplement de sèrum en el medi de MIV, constatant que no va incrementar el desenvolupament
d'embrions partenogenotes produïts mitjançant activació elèctrica ni d'aquells produïts mitjançant
SCNT.
D'altra banda, i per tal d'optimitzar la tècnica de l'ICSI es van abordar diferents aspectes com la
concentració de Ca2 + en el medi de microinjecció, el pretractament espermàtic amb Triton X-100 (TX),
així com l'addició de suplements de cafeïna o cisteïna al mitjà de cultiu in vitro (CIV) pos-ICSI, per tal
d'afavorir la descondensació del nucli espermàtic i l'activació oocitària. Observant que: i) la concentració
de Ca2+ no va influir en la taxa de divisió, ni en la de desenvolupament d'embrions partenogenotes
procedents d'oòcits microinjectats sense espermatozoïd (sham injection); ii) la cafeïna no va
incrementar la formació pronuclear ni en el desenvolupament embrionari posterior, i en combinació
amb el pretractament espermàtic amb TX va reduir l'activació oocitària i el desenvolupament
embrionari; iii) la formació pronuclear no es va veure incrementada pel pretractament espermàtic amb
TX ni pel tractament amb cisteïna, independentment del moment de l'avaluació estudiat. / García Mengual, ME. (2016). OPTIMIZACIÓN DE LAS ESTRATEGIAS REPRODUCTIVAS DE MICROMANIPULACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61448 / TESIS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/61448 |
| Date | 07 March 2016 |
| Creators | García Mengual, María Elena |
| Contributors | Garcia Rosello, Empar, Silvestre Camps, Miguel Ángel, Universitat Politècnica de València. Departamento de Ciencia Animal - Departament de Ciència Animal |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0146 seconds