Els teixits gàstrics de l'amfibi Rana perezi expressen una alcohol deshidrogenasa (ADH8) dependent de NADP(H), una especificitat de coenzim única dintre de les ADHs de vertebrat. Aquest enzim és actiu amb etanol i retinoides. Han estat resoltes i refinades les estructures tridimensionals de l'ADH8 i del complex binari ADH8-NADP+ a 2,2 i 1,8 Å, respectivament. ADH8 presenta una identitat de seqüència amb ADHs dependents de NAD(H) de vertebrat inferior al 60%. La seva especificitat de coenzim i de substrat suggereixen un paper d'aquest enzim en la reducció d'aldehids més que en l'oxidació d'alcohols. El gran volum del seti d'unió al substrat pot explicar les altes eficiències catalítiques d'ADH8 amb retinoides. La preferència per el NADP(H) sembla ser deguda a la presència en ADH8 de la triada Gly223-Thr224-His225, i al manteniment dels residus conservats Lys228 i Leu200, que defineixen un seti d'unió per el grup fosfat terminal del cofactor. El NADP(H) s'uneix a l'ADH8 amb una conformació extesa. Aquest coenzim es pot superposar amb el NAD(H) unit en complexos d'ADHs dependents de NAD(H). Les desviacions conformacionals més grans corresponen al grup adenina-ribosa de la molècula. No s'observaren diferències adicionals en el seti d'unió al dinucleòtid, fet que explicaria que el NAD(H) pugui també ser utilitzat com a cofactor per ADH8.En el complex crystal.logràfic ADH8-NADP+, el seti d'unió del grup fosfat extra del coenzim està format per Gly223-Thr224-His225, residus específics de l'ADH8, i per les posicions conservades Leu200 i Lys228. Amb l'objectiu d'investigar els mínims determinants estructurals responsables de l'especificitat de coenzim, diferents mutants d'ADH8 en les posicions 223-225 foren dissenyats i cinèticament caracteritzats. El mutant G223D, tot i presentar una càrrega negativa en el seti d'unió al fosfat, encara preferia el NADP(H) com a coenzim, de la mateixa manera que els mutants T224I i H225N. Les eficiències catalítiques amb NADP(H) disminuiren dramàticament en els dobles mutants, G223D/T224I i T224I/H225N, i en el triple mutant G223D/T224I/H225N (kcat/KmNADPH = 760 mM-1min-1), respecte l'enzim silvestre (kcat/KmNADPH = 133330 mM-1min-1). Aquest resultat fou associat amb una més baixa afinitat per el NADP+ i amb un canvi en l'etapa limitant de la reacció. Contràriament, en el triple mutant, l'eficiència catalítica amb NAD(H) incrementà, assolint valors (kcat/KmNADH = 155000 mM-1min-1) similars als de l'enzim silvestre amb NADP(H). La reversió completa de l'especificitat de coenzim de l'ADH8 doncs, fou aconseguida amb únicament la substitució de tres residus consecutius en el seti d'unió del fosfat extra, un resultat sense precedents dintre de la família ADH. / Gastric tissues from amphibian Rana perezi express an alcohol dehydrogenase (ADH8) with a distinct specificity for NADP(H) and active with ethanol and retinoids.The three-dimensional structures of ADH8 and of the binary complex ADH8-NADP+ have been determined and refined to resolutions of 2.2 and 1.8 Å, respectively. ADH8 exhibits less than 60% sequence identity with vertebrate NAD(H)-dependent ADHs. Its coenzyme and substrate specificity support a role in aldehyde reduction rather than in alcohol oxidation. The large volume of the substrate-binding pocket can explain the high catalytic efficiency of ADH8 with retinoids. Preference for NADP(H) appears to be achieved by the presence in ADH8 of the triad Gly223-Thr224-His225, and the recruitment of conserved Lys228 and Leu200, which define a binding pocket for the terminal phosphate group of the cofactor. NADP(H) binds ADH8 in an extended conformation and can be superimposed with NAD(H) in NAD(H)-dependent ADH complexes, the largest conformational deviations being for the adenine-ribose moiety of molecule. No additional reshaping of the dinucleotide binding site is observed which explains why NAD(H) can also be used as a cofactor by ADH8.In the crystallographic ADH8-NADP+ complex, a binding pocket for the extra phosphate group of coenzyme is formed by ADH8-specific residues Gly223-Thr224-His225, and the highly conserved Leu200 and Lys228. In order to investigate the minimal structural determinants for coenzyme specificity, several ADH8 mutants involving residues 223 to 225 were engineered and kinetically characterized. The G223D mutant, having a negative charge in the phosphate-binding site, still preferred NADP(H) over NAD(H), as did the T224I and H225N mutants. Catalytic efficiency with NADP(H) dropped dramatically in the double mutants, G223D/T224I and T224I/H225N, and in the triple mutant, G223D/T224I/H225N (kcat/KmNADPH = 760 mM-1min-1), as compared to the wild-type enzyme (kcat/KmNADPH = 133330 mM-1min-1). This was associated with a lower affinity for NADP+ and a change in the rate-limiting step. Conversely, in the triple mutant, catalytic efficiency with NAD(H) increased, reaching values (kcat/KmNADH = 155000 mM-1min-1) similar to those of the wild-type enzyme with NADP(H). The complete reversal of ADH8 coenzyme specificity was therefore attained by the substitution of only three consecutive residues in the phosphate-binding site, an unprecedented achievement within the ADH family.
Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3519 |
Date | 09 June 2004 |
Creators | Rosell Febres, Albert |
Contributors | Farrés i Vicén, Jaume, Parés i Casasampera, Xavier, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
Language | Catalan |
Detected Language | English |
Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
Format | application/pdf |
Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0026 seconds