Le suivi des flux calciques dans le cerveau de l’animal en mouvement nécessite de nouvellessondes. Nous utilisons la bioluminescence observée chez la méduse Aequorea victoria etimpliquant la protéine aequorine. Une fusion entre l’aequorine et la protéine fluorescente GFP(GA) permet d’obtenir un senseur calcique bioluminescent dont la stabilité et les propriétésspectrales sont adéquates pour de nombreuses applications. L’émission de bioluminescencepermet de suivre la propagation de l’information nerveuse de cellule en cellule, en temps réeldans des réseaux de neurones.Nous avons tout d’abord montré au moyen de construction de lignées transgéniques murinesque la protéine chimère GA peut être exprimée dans des microdomaines cellulaires pouranalyser l’activité neuronale. Nos résultats montrent pour la première fois qu’il est possibled’enregistrer in vivo et de manière non invasive dans l’animal en mouvement deschangements dans la concentration de calcium mitochondrial. Nous avons ensuite réalisé unciblage post synaptique du senseur par fusion à la protéine PSD95. Ce ciblage permet dedétecter l'entrée de calcium au niveau du récepteur NMDA.Parallèlement, nous avons cherché à améliorer les propriétés du senseur GA pour détécterl’activité calcique dans l’animal in toto. Nous identifié un nouvel analogue de lacoelenterazine conduisant à un décalage du spectre de bioluminescence de l’aequorine vers lerouge. Et par ailleurs, nous avons testé l’activité de l’aequorine en fusion avec diversesprotéines fluorescentes. Nous disposons avec ce travail de nouveaux senseurs bioluminescentspour le suivi de l’activité cérébrales dans des études comportementales. / Monitoring calcium fluxes in the brain of freely moving animals requires the development ofnew probes. We use the bioluminescence of the protein aequorin observed in the jellyfishAequorea victoria. A fusion between aequorin and GFP fluorescent protein (GA) provides abioluminescent calcium sensor whose stability and spectral properties are adequate for manyapplications. The emission of bioluminescence is suitable to track in real-time the propagationof nervous impulses from cell to cell in neural networks.We first showed by transgenic murine lines construction that the chimeric protein GA can beexpressed in cell microdomains to analyze neuronal activity. Our results show for the firsttime it is possible to record in vivo and non-invasively in the moving animal, changes in theconcentration of mitochondrial calcium. We then performed a post synaptic targeting of thesensor by fusion with the protein PSD95. This permits to detect the entry of calcium next tothe NMDA receptor.Meanwhile, we tried to improve the properties of the GA sensor to detect calcium activity inthe animal in toto and mor specifically through the skull. We identified a new analogue ofcoelenterazine leading to a shift in the spectrum of aequorin bioluminescence to red. We thentested the activity of aequorin fused with different fluorescent proteins. This leads to newbioluminescent sensors for monitoring the brain activity in behavioral studies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014PA066329 |
| Date | 24 September 2014 |
| Creators | Picaud, Sandrine |
| Contributors | Paris 6, Peyriéras, Nadine |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French, English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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