Hemofili A är en X-länkad ärftlig sjukdom som påverkar blodkoagulationen och beror på avsaknaden eller bristen på proteinet faktor VIII (fVIII). Nuwiq® är en rekombinant fVIII B- domän borttagen produkt från Octapharma AB som behandlar hemofili A och produceras med en cellinje av mänskliga njurceller från embryon. FVIII är 170 kDa som hel-längds protein, men klyvs till 90 kDa och 80 kDa kedjor innan de släpps ut i kroppen för cirkulation. Enligt reglementen måste 170 kDa kedjan vara under en specifik gräns under odlings processen för den farmaceutiska produkten och den relative distributionen av de tre olika isoformerna behövs mätas. Idag upparbetas proverna och analyseras med en droppkolon och reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC). Droppkolonen är en tidskrävande process och målet med detta projekt var att hitta en metod som kan förkorta tiden för detta analyssteg. I denna studie ska möjligheterna utvärderas för att använda Western Blot metod och att använda ett ÄKTA pure system för att rena proverna innan de analyseras med HPLC. Resultatet från Western Blot visa liknades resultat som HPLC analysen gör och en linjäritets, noggrannhets och precisions studie utfördes. Linjäritets studien resulterade i att provkoncentrationen bestämdes till 2 IU/mL. Noggrannhets testerna visade att det var liknande resultat men med mindre skillnader mellan de två metoderna och viss olikhet är förväntad då HPLC analyserar med avseende på hydrofobisitet och Western Blot använder antikroppar och kemiluminiscens. En mer omfattande precisions studie behövs innan några beslut kan tas angående en ändring av analysmetod. Western Blot visade lovande resultat och skulle förkorta metodtiden med ungefär 1-2 dagar. De första ÄKTA reningarna med odlingsprover visade inget protein i eluatet, men med en högre protein mängd pålagd på kolonen från ett prov med mindre cell rester hade eluatet en bra mängd protein i sig. Analysen av eluatet med Western Blot visade goda resultat. Fortsatta tester behövs göras med ÄKTA reningen för att metoden ska kunna betrakta det som en möjlig metod att använda på laboratoriet för att analysera faktor VIII protein. / Hemophilia A is a X-linked hereditary disease that effects the coagulation of the blood and is due to the absence or deficiency of the protein factor VIII (FVIII). Nuwiq® is a recombinant FVIII B-domain deleted product from Octapharma AB that treats hemophilia A and are produced with human embryonic kidney cell lines. The fVIII protein is 170 kDa full length but are cleaved into a 90 kDa chain and an 80 kDa chain before release into circulation in the body. Due to regulations the 170 kDa chain needs to be below a certain limit during the cultivation process of the pharmaceutical product and the relative distribution between the three isoforms needs to be measured. Today the sample is prepared and analysed through a drop column and reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC). The drop column is a time-consuming process and the aim for this project was to find a method that can reduce the time for this analysis step. This study investigated the possibilities to use Western Blot as a method and to use an ÄKTA pure system for the preparation of the samples and then analyse with HPLC. Results from Western Blot showed similar results as the HPLC analysis and a linearity, accuracy and precision study were performed. The linearity study showed promising results for a sample concentration of 2 IU/mL to be used. Accuracy testing showed similar but slightly different results between the two methods and some differences are expected since the HPLC analyses on hydrophobicity and Western Blot uses antibodies and chemiluminescence. There would need to be a more extensive precision study before any decision could be made about changing the analysis method. Western Blot showed promising results and would shorten the method time with around 1-2 days. The first ÄKTA purification runs with cultivation samples did not show any protein levels in the eluate, but with a higher protein amount put on the column from a sample with less cell debris the eluate had good amount of protein in it. The analysis of the eluate with Western Blot showed good results. Further testing of the ÄKTA purific tion is needed to consider it an option to use at the laboratory for analysis of factor VIII protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-348466 |
| Date | January 2024 |
| Creators | Johansson, Malin |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2024:239 |
Page generated in 0.0016 seconds