Le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) sont souvent associés à des maladies d'origine alimentaire incriminants des aliments minimalement transformés. Comme les méthodes de culture virale demeurent limitées pour une utilisation de routine, il est nécessaire de concentrer les virions présents à la surface des aliments avant leur détection. Le but ultime de cette étape est de séparer les virus de la matrice alimentaire, de les concentrer et d'éliminer les inhibiteurs pouvant affecter la détection. L'organisation internationale de normalisation (ISO) a publié des procédures de détection des virus dans les aliments. Cependant, elles varient grandement en fonction des aliments étudiés, tout en étant longues et laborieuses. Elles nécessitent aussi du personnel qualifié et comportent plusieurs étapes risquant de réduire la récupération virale, cela rendant leur utilisation difficile comme analyse de routine. C'est pourquoi le développement d'étapes de concentration, de purification et d'extraction du matériel génétique rapides et sensibles, limitant les étapes manuelles s'avère nécessaire. Le premier objectif de ce projet était de développer une nouvelle approche de concentration des virus en vue d'une meilleure surveillance dans les aliments. L'approche développée se base sur l'ultrafiltration pour une récupération des particules virales à la suite de leur élution de la surface d'aliments. La méthode optimisée a, par la suite, été comparée à la méthode de référence ISO 15 216-1 :2017 en utilisant des fraises, framboises et mûres fraîches et congelées ainsi que de la laitue et des oignons verts frais. Les résultats ont montré une réduction importante du temps d'expérimentation face à la méthode de référence, tout en conservant une détection à des faibles concentrations de VHA et des HuNoVs. Sauf pour la framboise, la méthode d'ultrafiltration était généralement équivalente à la méthode de référence, quel que soit le virus testé. Le deuxième objectif avait pour but de comparer une nouvelle méthode d'extraction automatisée optimisée pour les HuNoVs GI et GII puis le VHA à une méthode du commerce semi-automatisée applicable sur plusieurs matrices alimentaires à risque. Pour les framboises fraîches, les huîtres et la laitue romaine, les deux plateformes d'extraction ont été jugées équivalentes. Tandis que la méthode automatisée a permis une meilleure récupération pour les framboises congelées et une inhibition moindre pour les échantillons de mûres congelées. Le troisième objectif avait finalement pour but d'évaluer la persistance d'ARN de VHA provenant de virions inactivés à la chaleur. L'ARN était dilué à différentes concentrations puis ajouté à des solutions (eau et tampon phosphate salin) ou déposé sur des surfaces (acier inoxydable, polychlorure de vinyle et bleuets). La persistance de l'ARN était mesurée à différentes températures d'entreposage (-80 °C, -20 °C, 4 °C et 23 °C) sur une période de 90 Jours. En solution, sur le polychlorure de vinyle et sur les bleuets, l'ARN a été détecté dans la plupart des conditions jusqu'à 90 jours d'entreposage. Les résultats suggèrent cependant une dégradation plus rapide de l'ARN viral sur l'acier inoxydable. En conclusion, les résultats de cette thèse permettent de proposer une application de ces protocoles de concentration et d'extraction dans un contexte de routine, tout en mettant en lumière les enjeux liés à la persistance de l'ARN viral dans l'analyse des résultats de détection de virus dans les aliments. / Human norovirus (HuNoV) and hepatitis A virus (HAV) are often associated with foodborne illnesses involving minimally processed foods. As viral culture methods remain limited for routine use, it is necessary to concentrate virions present on foods before their detection. The goal of this step is to separate the viruses from the food matrix, to concentrate them and to eliminate inhibitors that may affect detection. The International Organization for Standardization (ISO) has published procedures for detecting viruses in food. However, they vary considerably depending on the foods to study, while being long and laborious. They also require trained personnel and involve several steps that may reduce viral recovery, making them difficult to use in routine analysis. This is why the development of rapid and sensitive concentration, purification, and extraction steps for genetic material, limiting manual steps, is necessary. The first objective of this project was to develop a new approach of virus concentration based on ultrafiltration of the eluted viral particles from the surface of food. The optimized method was subsequently compared to the reference method ISO 15 216-1:2017 using fresh and frozen strawberries, raspberries, and blackberries as well as fresh lettuce and green onions. The results showed a reduction in experimental time compared to the reference method, while maintaining detection at low concentrations of HAV and HuNoVs. Except for raspberry, the ultrafiltration method was generally equivalent to the reference method, regardless of the virus tested. The second objective was to compare a new automated extraction method optimized for VHA, HuNoVs GI and GII to a commercial semi-automated method applicable to several high-risk food matrices. For fresh raspberries, oysters, and romaine lettuce, the two extraction platforms were considered equivalent. While the automated method provided better recovery for frozen raspberries and less inhibition for frozen blackberry samples. The third objective was to evaluate the persistence of HAV RNA from heat-inactivated virions. RNA was diluted in water to different concentrations and then added to solutions (water and phosphate buffer saline) or laid on surfaces (stainless steel, polyvinyl chloride, and blueberries). RNA presence was measured at different storage temperatures (-80°C, -20°C, 4°C and 23°C) over a period of 90 days. In solution, on polyvinyl chloride and on blueberries, RNA was detected under most conditions for up to 90 days of storage. The results, however, showed a faster degradation of viral RNA on stainless steel. In conclusion, these concentration and extraction methods could be suitable for routine analysis of viruses throughout the food production and surveillance chain. The findings of this study also highlight the challenges associated with the persistence of viral RNA when interpreting results from virus detection in food.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/142643 |
| Date | 30 April 2024 |
| Creators | Trudel-Ferland, Mathilde |
| Contributors | Hamon, Fabienne, Jean, Julie |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xix, 229 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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