Der biologische Aufschluss lignocellulosehaltiger Biomasse mit Hilfe von Mikroorganismen oder ihrer Enzyme ist im Vergleich zu bekannten physikochemischen Verfahren umwelt- und ressourcenschonend. Der Einsatz geeigneter bakterieller oder pilzlicher Hydrolasen und Oxidoreduktasen in isolierten Form bedarf jedoch, aufgrund der noch zu geringen katalytischen Effizienzen und der nach wie vor zu hohen Herstellungskosten der Enzyme, weiterer Optimierung. Vor diesem Hinter-grund besteht, neben dem Ansatz einer gentechnischen Verbesserung der En-zym-Eigenschaften mittels protein oder metabolic engineering, die Möglichkeit einer prozesstechnischen Optimierung der Enzym-Präparate und ihrer Einsatzbe-dingungen. Dem letzteren Ansatz widmete sich die vorliegende Arbeit, in der ein bisher kommerziell nicht erhältliches Glycosidase-Gemisch aus dem ascomycetalen Schimmelpilz Penicillium janthinellum, der für seine hohen β-Glycosidase-Aktivitäten bekannt ist, im Zusammenhang mit dem enzymatischen Aufschluss faserreicher Substrate (Lignocellulosen) untersucht wurde. Ein Schwerpunkt lag dabei auf der kombinierten Anwendung des Glycosidase-Präparats mit zwei pilzlichen Peroxidasen (Mangan-Peroxidase, MnP und Dye-decolorizing-Peroxidase, DyP). Darüber hinaus wurden vergleichende Untersuchungen zu biologischen Aufschlussverfahren unter Einsatz pilzlicher Glycosidasen und/oder mikrobieller Vorkulturen durchgeführt.
Die untersuchten Lignocellulose-Substrate (Hölzer, strohähnliche Materialien) stammten aus der gemäßigten und tropischen Klimazone (Europa bzw. Kambodscha), und wurden in den Experimenten in zerkleinerter Form, allerdings ohne weitere Vorbehandlung, eingesetzt. Die Konzentration niedermolekularer Zucker (insbesondere Monosaccharide), die während des enzymatischen Aufschlusses aus den Substraten freigesetzt wurden sowie der Biogasertrag, der mittels anaerober Fermentation aus den enzymatisch und/oder mikrobiell vorbehandelten Substraten erzielt wurde, dienten zur Beurteilung der Effektivität der jeweiligen Vorbehandlung. Außerdem wurde die in den Experimenten verwendete mikrobielle Vorkultur soweit molekularbiologisch untersucht, dass die Bakterienart identifiziert werden konnte, die maßgeblich am Aufschluss der lignocellulosehaltigen Biomasse beteiligt war.
Die enzymatische Umsetzung der ausgewählten lignocellulosehaltigen Substrate mit Hilfe des Glycosidase-Gemisches aus P. janthinellum verlief erfolgreich und ist vergleichbar mit Ergebnissen, die laut Literatur unter Zuhilfenahme der effektivsten industriellen Cellulase-Präparate erzielt worden sind. Es wurden vorrangig Glucose und Xylose aus den verschiedenen Zellwand-Polysacchariden freigesetzt, wobei die Umsetzung von Cellulose und Hemicellulosen im Holz tropischer Laubbäume effizienter verlief als im Holz europäischer Laubbäume. Der Gehalt an Lignin und organischen Extraktiven beeinflusste – abgesehen von einigen artenspezifischen Inhibitoren – nur geringfügig den enzymatischen Aufschluss der Polysaccharid-Komponenten. Die Vorbehandlung mit dem Glycosidase-Präparat aus P. janthinellum führte zu einer Verbesserung der Biogasbildung und zum Ausbleiben der für faserreiche Substrate typischen Lag-Phase während der ers-ten Tage der anaeroben Vergärung der Lignocellulose aus Triticum sp. (Weizen-stroh) und Pinus sylvestris (Kiefernspäne). Dabei erhöhte sich der finale Biogasertrag innerhalb des Untersuchungszeitraums signifikant. Die genannten positiven Effekte einer enzymatischen Vorbehandlung könnten sich in kontinuierlich betriebenen großtechnischen Biogasanlagen als nützlich erweisen: Zum einen ließen sich die Gaserträge deutlich erhöhen und zum anderen könnte die erforderliche Verweilzeit des Substrates im Bioreaktor (Fermenter, Faulturm) und somit das benötigte Anlagenvolumen reduziert werden.
Eine vorausgehende Oxidation des im Substrat enthaltenen Lignins mit Hilfe der MnP erwies sich in der nachfolgenden Behandlung mit Glycosidasen als förderlich hinsichtlich der Freisetzung von Zuckern aus dem Holz von Fagus sylvatica (Rotbuche). Verglichen mit der häufig verwendeten Malonsäure war die Citronensäure, ein pilzlicher Metabolit des Intermediär-Stoffwechsels (Zitronensäurezyklus), ein wirksamerer Mangan-Chelator für diese Voroxidation mittels MnP. Dies hing möglicherweise mit der höheren chemischen Reaktivität der Citronensäure zu-sammen, was eine verstärkte Bildung chemischer Radikale zur Folge hatte. Eine enzymatische Vorbehandlung mittels DyP und dem Glycosidase-Gemisch in einer Reaktionskaskade wirkte sich ebenfalls positiv auf die Biogasbildung, in diesem Fall aus Bagasse von Saccharum officinarum (Zuckerrohr), aus. Dabei kam es wahrscheinlich auch zu einer partiellen Oxidation und Zerstörung des Lignins und damit zu einer Verbesserung der Zugänglichkeit der Zellwand-Polysaccharide. Im Ergebnis konnten Cellulose und Hemicellulosen in späteren Phasen der anaeroben Vergärung von den entsprechenden Mikroorganismen (Bakterien, Archaeen) besser verwertet werden. Der Voraufschluss mit Glycosidasen führte hingegen in der initialen Phase der anaeroben Vergärung zu positiven Effekten bezüglich der Biogasbildung, indem die bereitgestellten Einfachzucker (z.B. Glucose, Xylose) rasch in Methan umgewandelt wurden.
Beim Vergleich verschiedener biologischer Aufschlussverfahren erwies sich eine kombinierte Vorbehandlung des Substrates („Stroh“ von Miscanthus × giganteus), bestehend aus einer Vorhydrolyse durch das Glycosidase-Gemisch und einer Vorfermentation mit einer Mischkultur gärender Mikroorganismen, als der effektivste Weg. Durch die kombinierte biologische Vorbehandlung konnte ein ähnlich hoher Methanertrag wie für Maissilage (das derzeit optimale Substrat in Biogasanlagen) erreicht werden. In der entsprechenden mikrobiellen Vorkultur wurde ein Bacillus-Vertreter aus dem so genannten Bacillus-subtilis-Artkomplex (Bacillus subtilis species-complex) mittels klassischer mikrobiologischer und molekularbiologischer Analysen als möglicher „abbaurelevanter Organismus“ identifiziert. / The biological disintegration of lignocellulosic biomass by microorganisms and their enzymes is – in comparison to established physical and chemical approaches –environmentally friendly and sustainable. The broad use of isolated bacterial or fungal hydrolases and oxidoreductases requires, however, still substantial optimization because of too low catalytic performance and too high production costs for the enzymes. Against this background, there is the possibility, besides genetic improvement of enzyme properties by protein and metabolic engineering, to optimize the process performance of enzymes as well as the reaction conditions. The latter approach has been subject of the present dissertation, in the course of which a non-commercial preparation of glycosidases from the ascomycetous mold Penicillium janthinellum, which is well-known for its high β-glycosidase activities, was used for the enzymatic disintegration of fiber-rich substrates (lignocelluloses). Experimental work focused on the combined action of the glycosidase mixture with two fungal peroxidases (manganese peroxidase, MnP and dye-decolorizing peroxidase, DyP). Furthermore, comparing studies were carried out regarding enzymatic/biological lignocellulose disintegration by isolated fungal glycosidases and/or microbial precultures.
Lignocellulose substrates studied (wood, straw-like materials) originated from temperate and tropic climate zones (Europe and Cambodia, respectively) and were used after chopping in all experiments without further pretreatment. The concentration of low-molecular mass sugars (in first place monosaccharides), which were being released from the substrates during enzyme action as well as the biogas yield that was achieved via fermentation of enzymatically or microbiologically pretreated samples, were taken into consideration to evaluate the efficacy of respective treatments. Moreover, the microbial preculture used in the above experiments was analyzed on the molecular level to an extent that it was possible to identify a bacterial key species that was involved in the degradation of lignocellulosic biomass.
The enzymatic treatment of selected lignocellulosic substrates with the glycosidase mixture of P. janthinellum was successful and the results are – according to literature data – comparable to results reported for the best industrial cellulase preparations. In first place, glucose und xylose were released from different cell-wall polysaccharides, and the conversion of cellulose und hemicelluloses in the wood of tropical broad-leaved trees was more efficient than in wood of respective European trees. The content of lignin and organic extractives only slightly affected the enzymatic disintegration of polysaccharide components (apart from a few species-specific inhibitors). Substrate pretreatment with the glycosidase preparation of P. janthinellum resulted in an enhancement of biogas formation and in the disappearance of the lag-phase being characteristic for the conversion of fiber-rich substrates during the first days of anaerobic treatment of lignocelluloses from Triticum sp. (wheat straw) und Pinus sylvestris (wood shavings). In this context, the final biogas yields significantly increased in the course of the experiments. The observed positive effects of enzymatic pretreatment may be beneficially ap-plied in continuously working biogas plants. That way, on one hand, the gas yields could be considerably enhanced and on the other hand, the required retention time of the substrates in the bioreactor (fermenter, digestion tower) and hence the required reactor volume could be reduced.
The preceding oxidation of substrate-bound lignin with MnP turned out to be beneficial for the subsequent glycosidase treatment with respect to the release of sugars from beech wood (Fagus sylvatica). In comparison to widely used malonic acid, citric acid – a ubiquitous fungal metabolite of the intermediary metabolism (tricarboxylic acid cycle) –proved to be the more effective manganese chelator for the pre-oxidation of lignin by MnP. Probably this corresponds to the higher chemical reactivity of citric acid, which entails a forced formation of chemical radicals. Enzymatic substrate pretreatment with DyP and the glycosidase mixture within a reaction cascade had also a positive effect on the formation of biogas, in this case, from bagasse of Saccharum officinarum (sugar cane). During the respective treatment, the lignin might partially be oxidized as well and thereby, the availability of cell-wall polysaccharides was improved for hydrolase action. As the result, microorganisms (bacteria, archaea) consumed cellulose and hemicelluloses more efficiently during later phases of anaerobic fermentation. On the other hand, glycosidase pretreatments had positive effects in the initial phase of fermentation, regarding biogas formation from the ‘made-available’ monosaccharides (e.g. glucose, xylose) that were immediately converted into methane.
When comparing different biological methods to disintegrate lignocellulose, pre-hydrolysis with a glycosidase mixture combined with fermentative pretreatment proved to be the most effective option (demonstrated by the example of ‘straw’ from Miscanthus × giganteus). That way, a similarly high methane yield could be achieved as with maize silage (for the time being, the most suitable substrate used in biogas facilities). In the respective microbial preculture, a Bacillus species from the Bacillus subtilis species-complex was identified as a relevant potential degrader microbe by classic microbiological and molecular analyses.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:86942 |
| Date | 29 August 2023 |
| Creators | Harsányi, Judit |
| Contributors | Hofrichter, Martin, Wiegert, Thomas, Scheibner, Katrin, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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