O processo de biomineralização óssea é a deposição de cristais de fosfato de cálcio, na forma de hidroxiapatita formando o tecido ósseo. São mediados pelas vesículas da matriz (MVs) que são liberadas no local específico do início da biomineralização. As MVs contêm altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Para que isso ocorra corretamente são necessárias diversas proteínas/enzimas, bem como microambientes com condições específicas. Neste trabalho uma atenção especial foi dada a duas proteínas presentes nas MVs: Anexina V (AnxA5) e a nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase-1 (NPP1). A Anexina V é responsável pela formação de um canal de cálcio por meio da associação desta proteína tanto com a face externa quanto interna da membrana das MVs. A NPP1 possui a função principal de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP), formando adenosina monofosfato (AMP) e pirofosfato (PPi). Assim, experimentos de expressão de Anexina V e NPP1 foram realizados com o intuito de iniciar os estudos de interação entre as duas proteínas, por meio de reconstituição em lipossomos. A expressão de Anexina V foi realizada em células E. coli BL21(DE3) e induzida por isopropil -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG); para purificação, três procedimentos foram necessários, utilizando coluna de níquel, coluna Desalting e coluna de troca iônica (Mono-Q). Experimentos de dicroísmo circular foram realizados com amostras de Anexina V após purificação e mostraram que todas as amostras apresentavam estruturas em -hélice. Pelo método da gota pendente foi estudada a interação de Anexina V com íons Ca2+ (10 mM) em monocamadas constituídas por dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e de uma mistura de composição lipídica 9:1 de DPPC e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS). Os dados obtidos mostraram alta afinidade de Anexina V por monocamadas constituídas de (9:1) DPPC:DPPS na presença de íons Ca2+. A expressão de NPP1 foi realizada com transfecção por meio de eletroporação do DNA recombinante em células COS-1, e seleção com antibiótico G418 após 24 horas de cultivo. Amostras de fração de membrana controle e NPP1 recombinante foram preparadas após 60 horas de cultivo celular e foi observada atividade catalítica na amostra de fração de membrana da NPP1. Todas as amostras de expressão, tanto de Anexina V e NPP1, foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. A padronização da Anexina V foi obtida com sucesso, porém com relação à NPP1, experimentos ainda devem ser realizados a fim de padronizar a obtenção desta proteína recombinante em quantidade suficiente para continuar os estudos. / The bone biomineralization process is the deposition of calcium phosphate crystals in the form of hydroxyapatite forming the bone tissue. They are mediated by matrix vesicles (MVs) that are released at the specific site of the onset of biomineralization. MVs contain high concentrations of Ca2+ ions and inorganic phosphate (Pi), providing a suitable microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. To occur properly, several proteins/enzymes are needed, as well as microenvironments with very particular conditions. In this work, special attention should be given to two proteins present in the MVs: Annexin V (AnxA5) and nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase (NPP1). Annexin V is responsible for the formation of a calcium channel through the association of this protein with both the outer and the inner face of the MVs membrane. NPP1 has the main function of hydrolyzing adenosine triphosphate (ATP), adenosine monophosphate (AMP) and pyrophosphate (PPi).Thus, experiments of expression of Annexin V and NPP1 were performed with the aim of initiating the interaction studies between the two proteins, through reconstitution in liposomes. Annexin V expression was performed in E.coli BL21 (DE3) and the cells were induced by isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG); for purification, three procedures were required using a nickel column, a Desalting column and an ion exchange column (Mono-Q). Circular dichroism experiments were performed with Annexin V samples after purification and showed that all samples contain -helix structures. Using the pendant drop method, the interaction of Annexin V with (10 mM) Ca2+ ions was studied in monolayers composed of dipalmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC) and a mixture of lipid composition 9:1 DPPC and dipalmitoyl-phosphatidyl-serine (DPPS). Data showed high affinity of Annexin V by monolayers constituted of (9: 1) DPPC:DPPS in the presence of Ca2+ ions. NPP1 expression was performed with transfection by electroporation of the recombinant DNA into COS-1 cells and selection with G418 antibiotic after 24 hours of culture. Samples of the control membrane fraction and recombinant NPP1 were prepared and the activity of the membrane fraction of NPP1 was observed in the samples. All expression samples, both AnxA5 and NPP1, were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The standardization of Annexin V has been obtained with success, but regarding NPP1, experiments have yet to be performed to standardize the production of this recombinant protein and to obtain enough quantity to continue the study.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03042018-080740 |
| Date | 23 February 2018 |
| Creators | Janku, Tatiane Aparecida Buzanello |
| Contributors | Ciancaglini, Pietro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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