Tesis presentada a la Universidad de Chile
para optar al grado de Doctor en Farmacología / En abril del año 2015, la organización mundial de la salud (OMS), presentó un
informe que reveló la situación actual en torno a la resistencia a antimicrobianos de
114 países, lo que dejó en evidencia un preocupante escenario: el fenómeno de la
resistencia se encuentra diseminado en todo el orbe y está presente en una gran
variedad de patógenos responsables de infecciones comunes, tales como: las del
tracto urinario, la gonorrea, la diarrea, la neumonía y la sepsis. Dentro de estos
agentes se encuentran diversos bacilos Gram negativos, Staphylococcus aureus
resistente a meticilina y Enterococcus spp. resistente a vancomicina, siendo estos
últimos responsables de enfermedades con altos índices de mortalidad, como son
la sepsis y la endocarditis. A este escenario se suma el escaso avance e inversión
por parte de las grandes industrias farmacéutica en el desarrollo de nuevos
antimicrobianos. Frente a esto, el año 2010, la Sociedad Americana de
Enfermedades Infecciosas (IDSA) en conjunto a otras entidades, lanzaron el
programa “The 10x‘20 Initiative: Pursuing a Global Commitment to Develop 10 New
Antibacterial Drugs by 2020”, una iniciativa que busca hacer un llamado a los
diferentes actores de la salud pública mundial, a incentivar el desarrollo de nuevas
entidades moleculares (NEMs) con actividad antimicrobiana para el año 2020. El
Laboratorio de Desarrollo de Fármacos de la Universidad de Chile ha trabajado en
la desarrollo de compuestos arilmercaptoquinonicos diseñados racionalmente a
partir de la estructura de la ubiquinona, buscando intervenir la cadena de
transportadora de electrones bacteriana (CTeB). Resultados previos han
demostrado que los compuestos obtenidos poseen una interesante actividad sobre
bacterias Gram positivas tales como S. aureus resistente a meticilina, S. aureus
sensible a meticilina y E. faecalis. De la serie de compuestos sintetizados
destacaron; DFUCh-O5 y DFUCh-P4. En la presente investigación se buscó
determinar el potencial de aplicación terapéutica de los derivados sintetizados y con
ello discernir cuál es el mejor candidato para poder avanzar a fases preclínicas que
consideren la utilización de modelos animales. En primer término, se estudió la
toxicidad de los compuestos sobre células humanas y murinas a través del método
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de MTT. Además, se determinaron los valores Concentración Inhibitoria Mínima90
(CIM90) y Concentración Bactericida Minima90 (CBM90) para los derivados en estudio
de acuerdo a las normas de CLSI, sobre población de aislamientos clínicos de S.
aureus y E. faecium multirresistentes, obtenidos desde distintos sitios estériles
(sangre, huesos, etc.) y diferentes centros hospitalarias de todo Chile durante el año
2014, provistos por el Instituto de Salud Pública de Chile.
Se caracterizó la actividad antibacteriana de los derivados, a través de la
cuantificación del efecto post-antibiótico, el estudios de las curvas de muerte de los
derivados, el potencial de inducción de mutaciones de los derivados sobre cultivos
expuesto en forma aguda y crónica a estos. Por otra parte, se evaluó la actividad de
los compuestos en asociación con linezolid, vancomicina y daptomicina, por
determinación del índice de CFI (Concentración Fraccionaria Inhibitoria).
Adicionalmente, se determinó el porcentaje de unión a albumina de los derivados y
se estudió cómo influye esta proteína en la actividad de los compuestos in vitro. Por
último, se estudió la efectividad in vivo utilizando un modelo de infección en larvas
de Galleria mellonella.
Se evidenció que DFUCh-O5 y DFUCh-P4 no afectan la viabilidad de células
mamíferas; HeLa, SH-SY5Y y H4-II-E-C3, a las concentraciones en que son activos
como antibacterianos. Los compuestos poseen CIM90 similar a la exhibida por
vancomicina sobre los aislamientos clínicos de S. aureus resistentes a meticilina.
Frente a los aislamientos de E. faecium resistentes a vancomicina estudiados,
DFUCh-P4 resultó 64 veces más activo que vancomicina y DFUCh-O5 128 veces
más activo que esté fármaco. Los derivados son bactericidas en todos los
aislamientos estudiados. En los estudios de cinética de muerte, los compuesto
tardaron menos de 2 horas en reducir el 99,9% de la población bacteriana
ensayada. Los derivados no tienen efecto post antibiótico significativo sobre las
especies S. aureus y Enterococcus sp. prototipo. Ambos derivados tienen potencial
de inducir mutaciones frente a una exposición aguda y cronica en S. aureus
resistente a meticilina, pero estas mutaciones no se mantienen en la generaciones
sucesivas de la población bacteriana. DFUCh-P4 y DFUCh-O5 poseen la misma
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efectividad que vancomicina sobre los modelos de infección en G. mellonela
provocado por S. aureus sensible a meticilina o E. faecalis.
En este trabajo se demostró, que los derivados poseen potencial terapéuticos como
compuestos antibacterianos de uso humano, ya que poseen una alta actividad sobre
bacterias Gram positivas multirresistentes y no afectan la viabilidad de células
mamíferas / In April 2015, the World Health Organization (WHO) presented a report that revealed
the current situation regarding antimicrobial resistance in 114 countries, which
revealed a dangerous scenario: the phenomenon of resistance It is disseminated
throughout the world and is present in a wide variety of pathogens responsible for
common infections, such as those of the urinary tract, gonorrhea, diarrhea,
pneumonia and sepsis. Among these agents are Gram-negative bacilli, methicillinresistant
Staphylococcus aureus (MRSA) and Enterococcus sp. Resistant to
vancomycin (ERV), are the last responsible for diseases with high mortality rates,
such as child sepsis and endocarditis. Added to this scenario is the scarce
advancement and investment by large pharmaceutical companies in the
development of new antimicrobials. In response to this, in 2010, the American
Society for Infectious Diseases (IDSA), together with other entities, launched the
program "The 10x'20 Initiative: Looking for a global commitment to develop 10 new
antibacterial drugs by 2020", an initiative that. The Drug Development Laboratory of
the University of Chile has worked on the development of new resources for the
development of new molecular entities (NEMs) with antimicrobial activity for the year
2020. Arilmercaptoquinonics compounds rationally designed from the structure of
ubiquinone, looking to block the bacterial electron transport chain (CTeB). Previous
results have shown that the compounds obtained have an interesting activity on
Gram-positive bacteria such as S. aureus susceptible to methicillin, MRSA and
Enterococcus faecalis. From the series of synthesized compounds, it highlighted;
DFUCh-O5 and DFUCh-P4. In the present investigation, we sought to determine the
potential of therapeutic application of the synthesized derivatives and thereby
discern which is the best candidate to be able to advance to preclinical phases that
consider the use of animal models. First, the toxicity of the compounds was studied
on human and murine cells through the MTT method. The values MIC90 and MBC90
were determined for the derivatives under study according to CLSI standards, on
population of clinical isolates of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium
multiresistant, isolated from different sterile sites (blood, bones, etc.) and different
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hospital centers of Chile during 2014, provided by the Institute of Public Health of
Chile.
The antibacterial activity of the derivatives was characterized, through the
quantification of the post-antibiotic effect, the studies of the time-kill curves of the
derivatives, the potential for the induction of mutations of the derivatives on cultures
exposed in acute and chronic form to these. On the other hand, the activity of the
compounds in association with linezolid, vancomycin and daptomycin was evaluated
by determining the CFI index (Fractional Inhibitory Concentration) In addition, the
albumin binding percentage of the derivatives was determined and this protein was
studied. in the activity of the compounds in vitro Finally, effectiveness was studied in
vivo using a model of infection in larvae of Galleria mellonella.
Evidence of DFUCh-O5 and DFUCh-P4 does not affect the viability of
mammalian cells; HeLa, SH-SY5Y and H4-II-E-C3, at concentrations that are active
as antibacterial drugs. The compounds possess a vancomycin-like activity on the
clinical isolates of S. aureus resistant to methicillin. Faced with the isolates of
vancomycin-resistant E. faecium studied, DFUCh-P4 was 64 times more active than
vancomycin and DFUCh-O5 was 128 times more active than the drug. The activity
exhibited is bactericidal in all isolates studied. In studies of death kinetics, isolation
took less than hours to reduce 99.9% of the bacterial population tested. The
compounds have no significant post-antibiotic effect on S. aureus and Enterococcus
spp. prototype. Both derivatives have the potential to induce mutations in the face of
acute and chronic MRSA exposure, but these mutations are not maintained in
successive generations of the bacterial population. DFUCh-P4 and DFUCh-O5 have
the same effectiveness than vancomycin on G. mellonela model infection by S.
aureus or E. faecalis.
In this study it was demonstrated that the derivatives have therapeutic potential
as antibacterial compounds for human use, since they have a high activity on
multiresistant Gram positive bacteria and do not affect the viability of mammalian
cells
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/171816 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Campanini Salinas, Javier Andres |
| Contributors | González Rocha, Gerardo, Vásquez Velásquez, David |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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