A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey
using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside.
A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera
Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the
Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the
rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long
time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of
interest for scientists and have been studied intensively.
Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this,
the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds.
Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green
stomach”.
Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms
which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion
process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting
substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the
digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA
transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on
Dionaea’s physiological responses.
Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the
jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the
defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been
restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the
frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction
of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap,
the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1-
receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive
fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it
could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level
and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases.
Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress
hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by
guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation
prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from
previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of
trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive,
the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway
is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated.
In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to
mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced
the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that
already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to
initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48
hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200
μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application
of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop
the digestion process, if corresponding external stimuli are received.
Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic
jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after
mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able
to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be
that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to
react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal.
Further research is required at this point.
Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of
Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of
mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key
regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism.
In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant
parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines.
Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the
reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for
the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs. / Ein Teil des Pflanzenreiches besteht aus einer Vielfalt fleischfressender Pflanzen. Einige fangen
ihre Beute mit klebrigen Blättern, andere haben Grubenfallen, aus denen die Beute nicht mehr
entkommen kann, wenn sie erst einmal hineingefallen ist. Ein seltener Fallentyp ist die
Klappfalle: Sie kommt im Pflanzenreich nur zweimal vor, in den Gattungen Aldrovanda und
Dionaea. Charles Darwin selbst beschrieb Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle, als "eine
der schönsten Pflanzen der Welt". Die Mechanismen der Erkennung, des Fangs und der
Nutzbarmachung von Beutetieren durch Dionaea sind seit langem von Interesse für die
Wissenschaft und wurden intensiv untersucht.
Dionaea hat weit geöffnete Fallen, die bei Kontakt Insekten fangen können. Dazu muss das
Insekt innerhalb von ca. 20-30 Sekunden zweimal die Triggerhaare der geöffneten Falle
berühren. Sobald die Beute gefangen ist, schließen sich die Fallenhälften fest und bilden einen
hermetisch verschlossenen sogenannten „grünen Magen“.
Bis vor einigen Jahren gab es nur wenige Informationen über die molekularen und
hormonellen Mechanismen, die zu Beutefang und Sekretion von Verdauungsflüssigkeiten
führen. Es ist bekannt, dass der Verdauungsprozess sehr viel Wasser verbraucht; daher sollte
in dieser Arbeit das Zusammenspiel von verdauungsauslösenden und verdauungshemmenden
Substanzen untersucht werden, um die Feinabstimmung des Verdauungsweges aufzuklären.
Ein besonderes Augenmerk wurde auf den Einfluss von Phytohormonen auf die mRNATranskriptzahlen
von Verdauungsproteinen nach verschiedenen Stimuli sowie auf deren
Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen von Dionaea gelegt.
Jasmonsäure (JA) und ihre mit Isoleucin konjugierte Form, JA-Ile, sind ein wichtiges Signal in
pflanzlichen Signaltransduktionsprozessen. In der Mehrzahl der nicht-karnivoren Pflanzen
sind Jasmonate entscheidend für die Abwehr von Herbivoren und Pathogenen. In Dionaea
wurde dieser Abwehrmechanismus für den offensiven Beutefang umstrukturiert. Eine Frage
in dieser Arbeit war also, wie die Häufigkeit der Triggerhaarberührungen mit der Bildung von
Jasmonaten und dem Verdauungsvorgang miteinander in Verbindung steht. Beim Kontakt von
Beute mit den Triggerhaaren im Inneren der Falle schließt sich diese, und es werden durch
Biosynthese Jasmonate gebildet. JA-Ile interagiert mit dem COI1-Rezeptor und aktiviert so den
Verdauungsweg, der zur Sekretion von Verdauungsflüssigkeit und zur Produktion von
Transportern führt, welche zur Aufnahme von aus Beute gewonnenen Nährstoffen benötigt
werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Triggerhaarberührungen
positiv mit der Höhe und der Dauer der Transkriptionsinduktion mehrerer Verdauungsenzyme
bzw. Verdauungshydrolasen korreliert.
Abscisinsäure (ABA) fungiert neben vielen anderen Funktionen als pflanzliches
„Trockenstresshormon“. Es wird entweder von Wurzeln als primärem Sensor für
Wassermangel oder von Schließzellen in den Blättern synthetisiert. ABA beeinflusst ein
Netzwerk von mehreren tausend Genen, deren Regulation die Pflanze auf Dürre vorbereitet und entsprechende Schutzmaßnahmen einleitet.
Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die 48-stündige Inkubation einer Dionaea-Falle mit
ABA die erforderliche Anzahl an Triggerhaarberührungen erhöhte, die für einen Fallenschluss
notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Aufbringen von
ABA auf intakte Fallen vor der mechanischen Stimulierung der Triggerhaare
(Mechanostimulation) die Expression von Verdauungsenzymen bereits bei einer
Inkubationszeit von nur 4 Stunden signifikant reduzierte. Das zeigte eindeutig, dass die
kurzzeitige Einwirkung von ABA bereits die Effekte von Jasmonaten blockiert, wenn es um den
Beginn des Verdauungsprozesses geht, aber keinen Einfluss auf den Fallenschluss hat. Eine
Inkubation für 24 und 48 Stunden mit 100 μM aktiver ABA hatte keine Auswirkung auf das
Wiederöffnen der Falle, nur sehr hohe Konzentrationen von 200 μM aktiver ABA hemmten
das Wiederöffnen der Falle, führten aber auch zu Gewebenekrose. Da ABA die Transkription
der Verdauungsenzyme reduzieren konnte, ist es wahrscheinlich, dass Dionaea den
Verdauungsvorgang stoppen kann, wenn entsprechende externe Signale empfangen werden.
Ein weiterer Einflussfaktor, welcher erst später erkannt wurde, war die Auswirkung des
verwundungsbedingten, sprunghaften systemischen Anstiegs der Jasmonatkonzentration auf
die Wirkung von extern aufgegebenen Phytohormonen. So wirksam ABA bei der Hemmung
der Markerhydrolasen-Expression nach Mechanostimulation in intakten Pflanzen war, so
konnte diese Inhibition nach Anwendung von ABA auf abgeschnittenen Fallen nicht mehr
beobachtet werden. Ein Grund könnte sein, dass das ABA-Signal in den Wurzeln
wahrgenommen wird und daher abgeschnittene Fallen nicht darauf reagieren konnten. Ein
anderer Grund könnte sein, dass die Verwundung das Gewebe für das ABA-Signal
desensibilisiert hat. An dieser Stelle besteht weiterer Forschungsbedarf.
Ebenfalls wurden Inhibitoren des Jasmonat-Weges verwendet, um ihre Wirkung auf die
Regulation des Beutefangzyklus von Dionaea zu untersuchen. Coronatine-O-methyloxim
erwies sich als wirksamer Inhibitor der durch Mechanostimulation induzierten Expression von
Verdauungsenzymen und bestätigte damit die zentrale regulatorische Rolle von Jasmonaten
für den Beutefangmechanismus von Dionaea.
Ein parallel laufendes Projekt war die Erzeugung von in vitro-Kulturen aus sterilisiertem
Saatgut und einzelnen Pflanzenteilen, das sich als sehr erfolgreich erwies, was für die
Erzeugung zukünftiger transgener Linien wichtig sein kann. Ebenfalls wurden Protoplasten aus
Blattgewebe erzeugt, diese wurden transient transformiert und exprimierten YFP nach einer
Inkubationszeit von 24 Stunden. In Zukunft könnte dies der Ausgangspunkt für die
Generierung transgener Linien sein und der Funktionsüberprüfung von DNA-Konstrukten sein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:27385 |
| Date | January 2022 |
| Creators | von Rüden, Martin Frederik |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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