La résistance aux antibiotiques représente l'une des menaces les plus sérieuses à la santé publique pour les années à venir. En effet, l'utilisation massive et parfois excessive de ces molécules phares de la médecine moderne a mené au développement de microorganismes capables de résister à leur action, posant alors un défi important lié au traitement des infections qu'ils engendrent. Ainsi, depuis déjà plusieurs années, la communauté scientifique déploie des efforts considérables afin de développer de nouvelles molécules antimicrobiennes qui pourraient servir d'alternatives à ces antibiotiques traditionnels. Ces recherches sont aussi très pertinentes pour le secteur alimentaire, car la demande pour des agents de conservation efficaces, sûrs et d'origine naturelle est grandissante en réponse aux inquiétudes par rapport à l'utilisation des molécules actuellement disponibles à cet effet (benzoates, nitrates, etc.). Les efforts de recherche soutenus dans les dernières décennies ont permis d'identifier une classe de molécules particulièrement prometteuse : les peptides antimicrobiens (PAMs). Ces petites molécules constituées d'acides aminés présentent plusieurs avantages qui en font de bons candidats comme alternatives aux molécules antibiotiques classiques, notamment leur spectre d'action étendu, leur faible propension à induire de la résistance microbienne et, dans plusieurs cas, leur origine naturelle. D'ailleurs, les biomasses marines, dont les poissons, sont de très bonnes sources de PAMs. Par exemple, plusieurs PAMs ont été isolés à partir de poissons de la famille des Scombridés (maquereaux, thons, etc.), dont certains montrent une forte homologie avec une enzyme ubiquitaire dans le monde naturel, soit la glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase (GAPDH). C'est donc sur la base d'une littérature scientifique étoffée que l'hypothèse directrice de ce projet, selon laquelle la modulation des propriétés physico-chimiques de PAMs issus de poissons de la famille des Scombridés et apparentés à la GAPDH permet d'améliorer leur activité antimicrobienne, a été émise. L'objectif général visé par le projet était d'étudier les relations structure-activité et les mécanismes d'action de ces PAMs afin de développer des peptides analogues dont l'activité antimicrobienne est améliorée. Cet objectif principal a été décliné en trois objectifs spécifiques permettant de mettre ladite hypothèse à l'épreuve. Le premier objectif spécifique du projet était d'établir des relations entre la structure chimique de ces peptides provenant de Scombridés et homologues à la GAPDH et leurs activités antibactérienne et antifongique. Pour ce faire, huit peptides ont été synthétisés, dont un PAM natif déjà connu dans la littérature et sept analogues chimiques dans lesquels certains résidus d'acide aminé ont été substitués. L'activité antimicrobienne de ces huit peptides a été testée sur plusieurs souches bactériennes et fongiques afin d'obtenir des valeurs de concentrations minimales inhibitrices. Leurs propriétés chimiques (notamment la charge nette et l'hydrophobicité) ont été déterminées et leurs structures secondaires ont été évaluées dans différents environnements chimiques par dichroïsme circulaire et par une méthode de prédiction bio-informatique. Les résultats de ces expériences ont permis de mettre en évidence que les analogues dont le caractère cationique était augmenté avaient une plus forte activité antimicrobienne, tandis qu'un autre analogue, plus hydrophobe, a montré une activité antifongique particulièrement intéressante. La structure secondaire des peptides, quant à elle, n'a pas d'impact majeur sur leur activité antimicrobienne. Le deuxième objectif spécifique était d'élucider le mécanisme d'action de ces différents analogues peptidiques. Parmi les huit analogues synthétisés et dont l'activité antimicrobienne a été testée, cinq ont été sélectionnés pour l'étude de leur mécanisme d'action. Les interactions entre ces peptides et les différents phospholipides sous forme de liposomes ont été analysées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Leur pouvoir de perméabilisation membranaire a aussi été évalué par une méthode expérimentale basée sur l'utilisation de deux colorants d'acides nucléiques présentant une capacité de perméabilisation membranaire différentielle en fonction de l'intégralité membranaire des microorganismes. Enfin, un grand nombre de simulations bio-informatiques de dynamique moléculaire ont été réalisées afin de visualiser et de quantifier les interactions à l'échelle atomique entre les analogues peptidiques et deux modèles membranaires de compositions lipidiques différentes simulant précisément les membranes des bactéries à Gram négatif et des bactéries à Gram positif. L'analyse des différentes données obtenues a permis de conclure que les peptides interagissent avec les phospholipides membranaires et que dans plusieurs cas, ils sont capables de perméabiliser la membrane cytoplasmique des microorganismes. Un lien évident, mais pas complètement limpide, entre cette capacité de perméabilisation membranaire et l'activité antimicrobienne a aussi pu être mis en évidence, suggérant un mécanisme mixte d'action impliquant aussi des cibles intracellulaires. En troisième lieu, la stabilité et l'innocuité de ces analogues peptidiques ont été évaluées. Ainsi, l'impact du pH et différentes concentrations de cations monovalents et divalents sur l'activité antimicrobienne des peptides ont été testés, de même que leur résistance à la dégradation thermolytique. La toxicité des peptides a été évaluée sur la base de tests d'activité hémolytique. Finalement, la stabilité dans le tractus gastro-intestinal de deux des peptides a été étudiée avec un modèle dynamique de digestion *in vitro* (TIM-1), lequel est un système spécifiquement conçu pour simuler le processus de digestion dans le tractus gastro-intestinal humain, ainsi que des analyses de chromatographie et de spectrométrie de masse. Les résultats obtenus ont montré que l'activité antimicrobienne des analogues était favorisée à pH acide, qu'elle était diminuée en présence de cations monovalents et complètement inhibée par la présence de cations divalents. De plus, il a pu être conclu que les peptides étudiés étaient très rapidement dégradés dans l'estomac et qu'ils avaient une activité hémolytique négligeable. Pour conclure, les travaux expérimentaux et *in silico* accomplis dans le cadre de ce projet de thèse ont permis de mettre en lumière des liens importants entre la structure chimique, l'activité antimicrobienne et le mécanisme d'action de ces PAMs issus de Scombridés et apparentés à la GAPDH. La stabilité et l'innocuité de ces peptides ont aussi été caractérisées, de sorte qu'un intéressant potentiel d'applications cliniques et alimentaires a pu être mis en évidence. Les fruits de ces efforts, ayant fait l'objet de publications scientifiques, représentent donc une contribution originale à la recherche portée sur le développement de nouvelles molécules antimicrobiennes qui pourraient, éventuellement, offrir des solutions au problème criant posé par la résistance des microorganismes aux antibiotiques classiques. / Antibiotic resistance represents one of the most serious threats to public health in the years ahead. Indeed, the massive and sometimes excessive use of these hallmark molecules of modern medicine has led to the development of microorganisms capable of resisting their action, posing a major challenge to the treatment of the infections they cause. For several years now, the scientific community has been making considerable efforts to develop new antimicrobial molecules that could serve as alternatives to these traditional antibiotics. This research is also highly relevant to the food sector, as the demand for effective, safe preservatives of natural origin is growing in response to concerns about the use of molecules currently available for this purpose (benzoates, nitrates, etc.). Sustained research efforts in recent decades have identified a particularly promising class of molecules: antimicrobial peptides (AMPs). These small molecules made up of amino acids offer several advantages that make them good candidates as alternatives to conventional antibiotic molecules, notably their broad spectrum of action, their low propensity to induce microbial resistance and, in many cases, their natural origin. Marine biomasses, including fish, are excellent sources of AMPs. For example, several AMPs have been isolated from fish of the Scombrids family (mackerel, tuna, etc.), some of which show strong homology with a ubiquitous enzyme in the natural world, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). It was therefore on the basis of an extensive scientific literature that the guiding hypothesis of this project - that modulation of the physico-chemical properties of GAPDH-related AMPs from Scombrids fish can improve their antimicrobial activity - was put forward. The overall aim of the project was to study the structure-activity relationships and mechanisms of action of these AMPs, in order to develop analogous peptides with enhanced antimicrobial activity. This main objective was broken down into three specific objectives to put the hypothesis to the test. The first specific objective of the project was to establish relationships between the chemical structure of these Scombrid-derived peptides homologous to GAPDH and their antibacterial and antifungal activities. To this end, eight peptides were synthesized, including a native AMP already known in the literature and seven chemical analogs in which certain amino acid residues were substituted. The antimicrobial activity of these eight peptides was tested on several bacterial and fungal strains to obtain minimum inhibitory concentration values. Their chemical properties (notably net charge and hydrophobicity) were determined, and their secondary structures were evaluated in different chemical environments using circular dichroism and a bioinformatics prediction method. The results of these experiments revealed that analogs with increased cationic character had stronger antimicrobial activity, while another, more hydrophobic analog showed particularly interesting antifungal activity. The secondary structure of the peptides had no major impact on their activity. The second specific objective was to elucidate the mechanism of action of these different peptide analogs. Of the eight analogs synthesized and tested for antimicrobial activity, five were selected for investigation of their mechanism of action. Interactions between these peptides and various phospholipids in liposome form were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy. Their capacity for membrane permeabilization was also assessed by an experimental method based on the use of two nucleic acid dyes with differential membrane permeabilization capacity as a function of microorganism membrane integrity. Finally, many molecular dynamics bioinformatics simulations were carried out to visualize and quantify the atomic-scale interactions between the peptide analogs and two membrane models with different lipid compositions, precisely simulating the membranes of Gram-negative and Gram-positive bacteria. Analysis of the various data obtained led to the conclusion that peptides interact with membrane phospholipids and, in several cases, are capable of permeabilizing the cytoplasmic membrane of microorganisms. An obvious, but not completely clear, link between this membrane permeabilization capacity and antimicrobial activity has also been demonstrated, suggesting a mixed mechanism of action involving intracellular targets. Thirdly, the stability and safety of these peptide analogs were assessed. The impact of pH and different concentrations of monovalent and divalent cations on the antimicrobial activity of the peptides was tested, as was their resistance to thermolytic degradation. Peptide toxicity was assessed based on hemolytic activity tests. Finally, the stability in the gastrointestinal tract of two of the peptides was studied with a dynamic *in vitro* digestion model (TIM-1), which is a system specifically designed to simulate the digestion process in the human gastrointestinal tract, as well as chromatography and mass spectrometry analyses. The results obtained showed that the antimicrobial activity of the analogs was enhanced at acidic pH, diminished in the presence of monovalent cations and completely inhibited in the presence of divalent cations. It was also concluded that the peptides were rapidly degraded in the stomach and had negligible hemolytic activity. In conclusion, the experimental and *in silico* work carried out as part of this thesis project has revealed important links between the chemical structure, antimicrobial activity and mechanism of action of these GAPDH-related AMPs from Scombrids. The stability and safety of these peptides were also characterized, so that an interesting potential for clinical and food applications could be highlighted. The fruits of these efforts, which have been the subject of scientific publications, thus represent an original contribution to research into the development of new antimicrobial molecules that could eventually offer solutions to the glaring problem posed by microorganism resistance to conventional antibiotics.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/142863 |
| Date | 30 April 2024 |
| Creators | Cashman-Kadri, Samuel |
| Contributors | Beaulieu, Lucie, Fliss, Ismaïl |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xxiv, 185 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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