Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2009-09-23T18:00:26Z
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Previous issue date: 2008 / Este trabalho objetivou construir um vetor baculoviral modificado capaz de
expressar proteínas heterólogas fusionadas à poliedrina e à cauda de hexahistidina
e utilizar esse vetor para expressão e purificação da proteína capsidial de
vírus do complexo viral do alho. Via PCR, foi sintetizado o fragmento PH (gene da
poliedrina fusionado a uma cauda de hexa-histidina). Entre a poliedrina e a cauda
de histidina foi inserido um sítio de NcoI. Na primeira tentativa de obtenção do
fragmento PH, em vez do gene da poliedrina, a reação de PCR amplificou uma
parte do genoma de Escherichia coli. Na segunda tentativa de obtenção do
fragmento PH, o gene da poliedrina foi amplificado, contudo foi verificado que
havia um erro no “primer” 5’ utilizado, que gerou alteração da fase do fragmento
PH. Somente na terceira tentativa (reação de PCR) o fragmento PH correto foi
obtido. O fragmento PH foi clonado no vetor pFastBac1 (Invitrogen), gerando o
vetor pFastPH. Um baculovírus recombinante vAcPH expressando a proteína PH
foi construído via transposição sítio-específica utilizando o kit “Bac-to-Bac”
(Invitrogen). Foi realizada análise da expressão de proteínas de células Tn5B
infectadas com vAcPH (72 hpi). SDS-PAGE mostrou presença de uma proteína de
peso molecular superior ao da poliedrina nativa e compatível com o esperado para
a proteína PH. Western Blot mostrou que essa proteína é reconhecida tanto por
anticorpo contra a poliedrina quanto por anticorpo contra a cauda de hexahistidina.
Além da obtenção do fragmento PH correto, também foram sintetizados,
via PCR, genes da capa protéica (de vírus presentes no complexo viral do alho:GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV) flanqueados por sítios de
NcoI. Esses genes foram comprovados por análise do padrão de restrição.
Futuramente, tais genes poderão ser clonados no pFastPH para gerar baculovírus
recombinantes expressando uma proteína de fusão “poliedrina + proteína capsidial
+ cauda de hexa-histidina” que poderá ser utilizada para produção de anticorpos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work goal was the production of a modified baculovirus vector capable
of expressing an heterologous protein fused to the polyhedrin and to an
hexahistidin tag. The PH fragment (polyhedrin gene with an NcoI site and a histidin
tag at its 3’ end) was synthesized through PCR reaction. In the first attempt to
obtain the PH fragment, instead of the polyhedrin gene, PCR reaction amplified a
fragment of Escherichia coli genome. In the second attempt, the problem was the
5’ “primer”, which had an extra nucleotide and disrupted the PH fragment reading
frame. In the third attempt, the correct PH fragment was obtained and cloned into
pFastBac1 vector (Invitrogen), generating pFastPH. A recombinant baculovirus
(vAcPH) expressing the PH protein was obtained through site-specific transposition
(“Bac-to-Bac” kit, Invitrogen). SDS-PAGE showed the presence of a protein with
molecular weight (MW) superior to the native polyhedrin MW (28,6 KDa). In
Western Blot experiment, PH protein was recognized by antibody against
polyhedrin and by antibody against hexahistidin tag, proving that the PH protein
was being expressed. Also, this work attempted to use the modified baculovirus
vector to express and purify the capsid protein of viruses present in the garlic virus
complex (GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV). NcoI sites were
added, through PCR, to both ends of these genes. In the future, these genes these
genes may be cloned in pFastPH vector to generate baculovirus expressing these
virus coat proteins fused to the PH gene. The purified fusion proteins may then be
used in experiments to obtain antibodies against them.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/5774 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Costa, Marcio Hedil Oliveira da |
| Contributors | Resende, Renato de Oliveira, Ribeiro, Bergmann Morais |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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