Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El Cáncer Gástrico es la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo. Las células citolíticas, como las células natural killer (NK) y linfocitos T, desempeñan un papel importante en la defensa inmune del huésped contra las células transformadas. Estas células expresan el receptor de activación NKG2D, cuyos ligandos, expresados en la superficie celular, pertenecen a las familias MIC (MICA y MICB) y ULBP/RAET (ULBP-1-6). Aunque está bien establecido que estos ligandos son generalmente sobreexpresados en las células tumorales, los tumores son capaces de crecer en huéspedes inmunocompetentes debido a mecanismos de escape del tumor a la inmunovigilancia mediada por el receptor NKG2D. Una de estas estrategias de inmunoevasión es el corte proteolítico de MICA desde la superficie de células tumorales; como consecuencia, el aumento en los niveles séricos de MICA soluble disminuiría la reactividad antitumoral de los linfocitos citotóxicos que expresan el receptor NKG2D. El objetivo de este trabajo se enmarca en I&D de un nuevo anticuerpo completamente humano anti-MICA con fines terapéuticos y consistió en la expresión y caracterización biológica de un fragmento de este anticuerpo (scFv-MICA), además de la expresión del antígeno (MICA) en células HEK293T.
La expresión de MICA se realizó a través de un proceso de transfección, entre el vector que porta el gen de la proteína y Polietilenimina Los niveles de concentración de MICA, en el sobrenadante de cultivo celular, fueron medidos por ELISA. Se realizó, además, una co-transfección con XBP1s, observándose un rendimiento 4 veces superior en comparación a una transfección simple. La expresión del scFv anti-MICA se realizó en bacterias E. coli (cepa HB2151), encontrándose principalmente en la fracción insoluble del lisado, con su consecuente purificación mediante la técnica de FPLC.
La caracterización biológica del scFv anti-MICA consistió en demostrar, por ELISA, su unión específica a MICA recombinante, además de su unión, por citometría de flujo, a MICA nativa presente en dos líneas celulares de Cáncer Gástrico (AGS y MKN-45). Sin embargo, no se pudo revertir los niveles de expresión del receptor NKG2D en células citolíticas (provenientes de PBMC) tratadas con 400 ng/mL de MICA recombinante en presencia del anticuerpo. Estos últimos resultados fueron probablemente provocados por acción del Imidazol, el cual generó más de un 50% de muerte celular. Sin embargo, consideramos que, en base a los resultados obtenidos durante este estudio, se podrían visualizar nuevas perspectivas en la metodología tanto de la expresión como purificación de scFv-MICA para futuros ensayos funcionales / Gastric Cancer is the second most common cause of cancer death worldwide. Cytolytic cells, such as natural killer (NK) cells and T lymphocytes, play an important role in the immune defense of the host against transformed cells. These cells express the activating receptor NKG2D, whose ligands, expressed on the cell surface of transformed cells, belong to the MIC (MICA and MICB) and ULBP/RAET (ULBP1-6) families. Although it is well established that these ligands are generally overexpressed in tumor cells, tumors can grow in immunocompetent hosts due to mechanisms of tumor escape from NKG2D-mediaed immunosurveillance. One of these immune evasion strategies is the proteolytic shedding of MICA from the surface of cancer cells; as a consequence, the increase in the serum levels of soluble MICA would compromise the anti-tumor reactivity mediated by NKG2D-bearing cytotoxic lymphocytes. The aim of this work was part of a R&D of a new and completely human antibody against MICA with therapeutic purposes and consisted in the expression and biological characterization of a fragment of this antibody (scFv-MICA). In addition, we also expressed MICA in HEK293T cells.
The expression of MICA was performed by transfection between the vector carrying the gene of the protein and Poly(ethylenimine). Levels of concentration of MICA in the culture supernatant were measured by ELISA. Was also performed a co-transfection with XBP1s, and observed 4 times higher performance compared to a simple transfection. The expression of the anti-MICA scFv was carried out in E. coli (strain HB2151). ScFv-MICA was found mainly in the insoluble fraction of the lysate, and its subsequent purification was performed by FPLC.
The biological characterization of anti-MICA scFv was demonstrated by ELISA, as it bound specifically to recombinant MICA. Binding of the antibody was also observed, by flow cytometry, to native MICA present in two human gastric adenocarcinoma cell lines (AGS and MKN-45). However, it was not possible to reverse the expression levels of NKG2D receptor on cytolytic cells (present in PBMC) treated with 400 ng/mL of recombinant MICA in the presence of the antibody. These latter results may have possibly been caused by the action of imidazole, which generated more than 50% cell death. Nevertheless, based on all the results presented herein, it is possible to visualize new insights into the development of better strategies to express and purify anti-MICA scFv for future functional assays / Fondef. Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/133998 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Contreras Reyes, Daniel Alberto |
| Contributors | Molina Sampayo, María Carmen, Bollo Dragnic, Soledad Viviana, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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