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Previous issue date: 2006-09-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Soybean is one of the most important crops in the world extensively used as a food and feed source. However, the proteins present in soybean seeds are not considered ideal because they contain low amounts of the essential amino acids methionine and lysine. Adverse nutritional and other effects following consumption of raw soybean meal have been attributed to the presence of endogenous inhibitors of digestive enzymes and allergenic factors. Among these proteins are the P34 protein and the Bowman-Birk protease inhibitors. The absence of these factors would increase the nutritional quality of the soybean seeds, as well as the availability of this product to large number of consumers. Recent advances in plant biotechnology have enabled the silencing of specific genes. One of the techniques used to achieve this goal is RNA interference (RNAi). This method of posttranscriptional gene silencing is highly efficient, especially when the construct results in the formation of a intron-spliced hairpin RNA. It is proposed that RNAi works by enzymatic RNA degradation induced by double-stranded RNA. The main goal of this work was to construct expression cassettes for RNAi-based silencing of genes encoding antinutritional factors in soybean seeds. To achieve seed-specific expression, specific primers were designed for the amplification of the promoter region of the alpha-subunit of the beta-conglycinin gene. Appropriate restriction sites - Sac I and Xho I - were added to the primers which were used to amplify a 634 bp fragment. This product was cloned into a pGEMTEasy vector and cloning was verified by PCR, enzymatic digestion and sequencing. The sequenced clone was analyzed in silico for identification of cis-elements related to seed specific expression. The elements TATA box, CAAT box, RY LEG box and RY FLEB box were found. The fragment of interest was isolated from vector pGEM-TEasy by cleavage with enzymes Sac I and Xho I and inserted in the expression vector pKANNIBAL. This new vector was designated pBKN. For the construction of the expression cassettes, primers were designed according to published sequences deposited in the GenBank. The fragments of interest were isolated by the RT-PCR method using RNA isolated from soybean seeds. RT-PCR was also used to analyze the expression of the gene of interest in the seed and in other organs of the plant (root, stem and leaves). These analyses showed that the expression of these genes was continuous and abundant during all stages of seed development, and the corresponding transcripts were present in all organs analyzed. The fragments obtained by RT-PCR were sequenced and their identity was confirmed by BLAST analysis. To clone the sense sequence, the vectors pKANNIBAL and pBKN, and the fragments of interest were cleaved with enzymes Xho I and Kpn I. The ligation reaction was catalyzed by T4 DNA ligase and competent cells of Escherichia coli were transformed by heat shock. Cloning was verified by PCR and enzymatic digestion. The cloning of the antisense fragment was done using restriction enzymes Xba I and Cla I and vectors containing the sense fragments. The complete expression cassettes were cloned into the binary vector pCAMBIA 3301 and verified by PCR. / A soja é uma das mais importantes culturas do mundo e como apresenta um alto teor protéico, ela tem sido muito utilizada na alimentação animal e humana. Apesar disso, as proteínas encontradas na semente desta leguminosa não são consideradas ideais por apresentarem baixo teor de metionina e lisina, além de fatores alergênicos e de inibidores de proteases. Dentre estes fatores antinutricionais estão a proteína P34 e os inibidores de protease do tipo Bowman-Birk. A ausência destes fatores aumentaria a qualidade da semente de soja, bem como a tornaria disponível para uma faixa mais ampla de consumidores. Recentes avanços na biotecnologia vegetal têm possibilitado o silenciamento completo ou em altos níveis de genes específicos. Uma destas técnicas é conhecida como interferência por RNA ou RNA interference. Este método é altamente eficiente e a clivagem do mRNA alvo é induzida pela presença de pequenos RNAs dupla fita na célula. O objetivo deste trabalho foi a construção de cassetes de expressão para silenciamento gênico, via interferência por RNA, dos inibidores de protease do tipo Bowman-Birk e da proteína P34 em sementes de soja. Para a expressão semente-específica dos transgenes, primers específicos foram desenhados para a amplificação da região promotora do gene da subunidade [alfa] da [beta]-conglicinina. A estes oligonucleotídeos foram adicionados sítios de restrição Sac I e Xho I - adequados para sua clonagem em vetores de expressão em plantas. Foram clonados 634 pb no vetor pGEM-TEasy. A clonagem foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento do clone isolado. A seqüência clonada foi analisada in silico para a identificação de cis-elementos relacionados à expressão semente específica de genes colocados sob controle deste promotor. Os elementos TATA box, CAAT box, RY LEG box e RY FLEB box encontrados. O fragmento de interesse foi, então, isolado do vetor pGEM-TEasy por clivagem com as enzimas Sac I e Xho I e inseridos em vetores de expressão em plantas (pKANNIBAL) originando o vetor pBKN. Para a construção dos cassetes de expressão, a escolha da região do cDNA de cada gene de interesse a ser amplificada foi determinada com o auxílio do programa BLOCK-iTTM RNAi Designer (INVITROGEN), e os primers específicos foram desenhados de acordo seqüências depositadas no banco de dados público GenBank. Inicialmente foi feita, por meio de RTPCR, uma análise da expressão dos genes de interesse durante o desenvolvimento da semente e em demais órgãos da planta (raiz, caule e folha). Essa análise evidenciou
expressão contínua e abundante desses genes durante todo o desenvolvimento da semente bem como a presença de transcritos correspondentes em todos os órgãos vegetais analisados. Após sua amplificação, todos os fragmentos obtidos a partir de cDNA de semente foram sequenciados e sua identificação foi confirmada por meio de alinhamento utilizando o programa BLAST. Para a clonagem da seqüência sense, os vetores pKANNIBAL e pBKN, além dos fragmentos amplificados referentes aos genes de interesse, foram clivados com as enzimas Xho I e Kpn I. A reação de ligação foi realizada utilizando T4 DNA ligase e células de Escherichia coli ultracompetentes foram transformadas por meio de choque térmico. Os transformantes foram analisados por PCR e reação de clivagem enzimática. A clonagem do fragmento antisense foi realizada da mesma forma, utilizando as enzimas Xba I e Cla I e os clones contendo o fragmento sense como vetores. Em seguida, as construções foram transferidas para o vetor binário pCAMBIA 3301 e confirmadas por PCR.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/4784 |
| Date | 29 September 2006 |
| Creators | Barros, Beatriz de Almeida |
| Contributors | Barros, Everaldo Gonçalves de, Oliveira, Luiz Orlando de, Otoni, Wagner Campos, Ribon, Andréa de Oliveira Barros, Lima, Andréia Barcelos Passos |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa, Mestrado em Genética e Melhoramento, UFV, BR, Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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