Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-04-26T16:08:11Z
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2017_LuzElenaTrianaVidal.pdf: 2903643 bytes, checksum: f3ab54636d42cbaaf15629d3af2ceef1 (MD5) / A pele dos anfíbios é um tecido especializado na produção de diversas moléculas como peptídeos antimicrobianos, imunomoduladores, aminas biogênicas e hormônios. Esses compostos bioativos podem ser considerados de interesse biotecnológico e alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi identificar e caracterizar peptídeos e proteínas presentes na secreção cutânea do anfíbio Dendropsophus columbianus (Boettger, 1892), relacionados aos mecanismos de defesa contra patógenos. A primeira abordagem consistiu no fracionamento clássico da secreção cutânea por RP-HPLC. Todas as frações cromatográficas obtidas foram avaliadas quanto à capacidade de inibir a proliferação bacteriana e analisadas por MALDI-TOF/TOF. Um único e novo (sem similaridade de sequência com peptídeos anotados) peptídeo antimicrobiano neutro foi assim isolado e denominado Dendropsofina 1 (Dc 1). Posteriormente, foram desenhados dois análogos catiônicos (Dc 1.1 e Dc 1.2) que mantiveram a estrutura anfipática de Dc 1. Dc 1 e seus dois análogos exibiram atividades antibacterianas moderadas e sem efeitos hemolíticos e citotóxicos em células de mamífero. O Análogo Dc 1.2 exibiu uma maior atividade antibacteriana, o que pode estar relacionado ao seu maior teor de α-hélice e estabilidade térmica em condição experimental hidrofóbica, comparando com Dc 1 e Dc 1.1. O peptídeo nativo Dc1 poderia ser usado como um modelo alternativo para desenvolver novos AMPs. Numa segunda abordagem, mais moderna e de alta acurácia, foi realizado o primeiro estudo proteômico e peptidômico abrangente da secreção cutânea utilizando nanoLC-MS/MS do tipo Orbitrap Elite™. Os dados foram processados através dos softwares PEAKS e Blast2GO. Foram identificadas 1248 proteínas presentes na secreção cutânea de D. columbianus, 127 proteínas foram categorizadas como associadas ao sistema de defesa e 19 relacionadas à resposta contra microrganismos. Mediante zimografia foram detectadas e posteriormente identificadas três hidrolases ativas na secreção total, as quais podem estar relacionadas com o processamento de peptídeos de defesa. Os resultados do peptidoma permitiram determinar um novo grupo de peptídeos endógenos a D. columbianus, com alta similaridade de sequência com Dc 1, que foram nomeados como dendropsofinas. As dendropsofinas Dc2, Dc7, DC13, Dc 17, Dc 18 e Dc 19 não apresentaram atividade contra bactérias nem fungos. No entanto, Dc 2 e Dc 18 foram capazes de ativar neutrófilos humanos. Essa atividade poderia estar associada a uma modulação do sistema imune em D. columbianus. Esta via de defesa altamente conservada em vertebrados, abre perspectivas quanto ao uso dessas novas moléculas na terapia de doenças infecciosas. / Amphibian skin is a tissue specialized in the production of various molecules such as antimicrobial peptides, immunomodulators, biogenic amines and hormones. These bioactives compounds could be considered of biotechnological interest and new therapeutic alternatives. The aim of the present study was to identify and characterize peptides and proteins present in the cutaneous secretion of the amphibian Dendropsophus columbianus (Boettger, 1892), related to pathogen defense mechanisms. The first approach consisted of the classical fractionation of cutaneous secretion by RP-HPLC. All chromatographic fractions obtained were evaluated for their ability to inhibit bacterial proliferation and analyzed by MALDI-TOF / TOF. A single new antimicrobial neutral peptide was thus isolated and named Dendropsophin 1 (Dc 1), with no sequence similarity with annotated peptides. Subsequently, two cationic analogues (Dc 1.1 and Dc 1.2) keeping the amphipathic structure of Dc 1 were designed. Dc 1 and its two analogues exhibited moderate antibacterial activities and no hemolytic and cytotoxic effects in mammalian cells. Dc 1.2 exhibited slightly improved antibacterial properties that could be related to the higher content of α-helix and thermal stability compared to Dc 1 and Dc 1.1 in hydrophobic experimental condition. The native peptide Dc 1 could be used as an alternative model to develop new AMPs. In a second modern high-throughput approach, the first comprehensive proteomic and peptidomic study of cutaneous secretion was performed by nanoLC-MS/MS using Orbitrap Elite™ mass spectrometer. Data were processed using PEAKS and Blast2GO programs. 1248 proteins present in the cutaneous secretion of D. columbianus were identified, 127 proteins were categorized associated with the defense system and 19 related to the response against microorganisms. Three hydrolases from the total secretion were detected by zymography and subsequently identified, which could be related to the processing of peptides of defense. The peptidome results allowed determining a new group of peptides endogenous to D. columbianus, with high sequence similarity with Dc 1, which were named as Dendropsophins. The dendropsophins Dc 2, Dc 7, Dc 13, Dc 17, Dc 18 and Dc 19 showed no activity against bacteria or fungi. However, Dc 2 and Dc 18 are able to activate human neutrophils. This activity could be associated to a modulation of the immune system in D. columbianus. This pathway of defense, highly conserved in vertebrates, opens further perspectives regarding the use of these new molecules in the therapy of infectious diseases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/23393 |
| Date | 14 March 2017 |
| Creators | Vidal, Luz Elena Triana |
| Contributors | Charneau, Sébastien Olivier |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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