In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt. / In multicellular organisms, apoptosis (one kind of programmed cell death) is a highly regulated natural process that can remove unwanted, redundant, or damaged cells in an orderly non-inflammatory way. In a typical human being, billions of cells undergo apoptosis every day. That way the organism can control the cell number and the size of a tissue. A dysregulation of apoptosis can have extensive consequences. While insufficient apoptosis can manifest as autoimmunity or cancer, accelerated cell death can lead to immunodeficiency or acute and chronic degenerative diseases. Therefore, analysis of apoptosis is of great importance. Mitochondria play a key role in the regulation of cell death. In the progress of apoptosis, mediators of apoptosis can be released from these organelles. These mediators then participate in the activation of caspases, enzymes that degrade proteins and as a consequence regulate the degradation of DNA. Proteins of the Bcl-2 family consisting of pro- and anti-apoptotic members, control the integrity of the mitochondria mainly by protein-protein and protein-membrane interactions. Many anti-apoptotic members of the Bcl-2 family are able to bind to the outer mitochondrial membrane by a C-terminal transmembrane domain. A1, an anti-apoptotic member of this protein family, lacks this typical transmembrane domain. Function and localization of this protein are discussed very controversially. Therefore, the aim of this thesis was to analyze the localization and function of A1. The intracellular distribution of various versions of genetically modified A1 proteins was analyzed by confocal microscopy. Eventually, the contribution of the proteasomal degradation pathway in regulating the amount of A1 inside cells was investigated by applying relevant inhibitors. By fusing the C-terminal end of A1 to the enhanced green fluorescent protein, we analyzed the function and localization features of the A1 C-terminus by confocal microscopy and flow-cytometry. We could show that the C-terminal end of A1 made the chimeric protein very unstable. Treating the cells with a proteasomal inhibitor lead to a stabilization of the fusion protein. Furthermore the chimeric protein showed a diffuse distribution in 293T cells. These results indicate that the C-terminus of A1 is not sufficient to mediate localization to special intracellular organelles, but is responsible for the instability and proteasomal degradation of the protein. By analyzing the localization of the full length protein A1 in 293T cells by confocal microscopy we could demonstrate that A1 is mainly found in the cytosol with accumulation at the mitochondria. As the C-terminus of A1 by itself was not sufficient for specific intracellular targeting of the protein, other N-terminal regions of A1 seem to contribute in targeting the protein to these organelles. Taken together, we could show that the C-terminus of A1 plays an important role for the stability of this anti-apoptotic Bcl-2 family member.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:3001 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Zeitz, Jonas |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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