Dans ce travail, nous étudions l’adsorption de protéines sur des surfaces chimiquement contrôlées. Le but est d’établir le lien entre les propriétés physico-chimiques de la surface (hydrophobicité /charge) et la structure physique de protéines. Des couches auto-assemblées de thiols ayant des groupements terminaux différents sont formées sur des surfaces d’or (SAM) et servent de support à l’adsorption ou du greffage de protéines. Les SAM sont caractérisés, avant ou après l’adsorption de protéines, avec une combinaison de techniques. Des analyses ex situ sont réalisées, dans l’air, en spectroscopie infrarouge en lumière polarisée (PM-IRRAS) ou, sous ultra-vide, en spectroscopie des photoelectrons X (XPS) et en spectrométrie de masse d’ions secondaires (ToF-SIMS). L’analyse en composante principale (PCA) des résultats ToF-SIMS aide à révéler l’orientation des protéines adsorbées grâce à la répartition des fragments d’acides aminés. En microbalance à quartz avec mesure de la dissipation (QCM-D), l’adsorption des protéines est suivie in situ (i.e. en phase liquide). Deux protéines globulaires ayant des propriétés structurales différentes sont d’abord étudiées, la β-Lactoglobuline (βLG) est dite dure quand l’albumine de sérum bovin (BSA) est dite souple. Des orientations différentes sont proposées après adsorption sur les SAM. Un cas plus complexe est ensuite étudié avec l’adsorption ou le greffage d’un anticorps sur les surfaces. De nouveau, différentes orientations sont proposées et elles sont corrélées à des mesures de bio-reconnaissances. En conclusion, cette thèse établie une méthodologie de détermination directe et sans marquage de l’orientation de protéines adsorbées. / In this work we studied protein adsorption on chemically well-controlled surfaces. The focus is put on linking physico-chemical properties of surfaces (hydrophobicity/charge) to the structural properties of the adsorbed proteins. To this end, alkyl thiols differing by their end group were used to build self-assembled monolayers on gold substrates (SAM) that serve as templates for protein adsorption or covalent grafting. SAM surfaces before and after protein adsorption were characterized with a combination of techniques. Ex situ analysis were carried out, in air with polarization-modulated infrared reflection absorption spectroscopy (PM-IRRAS), or in vacuum using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). ToF-SIMS results were analyzed statistically in principal component analysis (PCA) to reveal preferential orientations based on amino acids fragments distributions. Protein adsorption was also followed directly in situ (i.e. in the liquid phase) with quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D). Two model proteins – β-Lactoglobulin (βLG) and bovine serum albumin (BSA) – were first studied. They are both model globular proteins with different structural properties (βLG is hard while BSA is soft). Different orientations were proposed for both proteins on each SAM surface. A more complex case was then studied with the adsorption and grafting of a monoclonal antibody on the SAM. Again differences in orientations were determined and correlated to biorecognition measurements. In conclusion, this thesis establishes a methodology for the direct label free determination of protein orientation on surfaces.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014PA066095 |
| Date | 14 May 2014 |
| Creators | Lebec, Victor |
| Contributors | Paris 6, Université catholique de Louvain (1970-....), Delcorte, Arnaud, Pradier, Claire-Marie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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